‘正午’牡丹微繁殖技術(shù)體系的優(yōu)化*

文書(shū)生 成仿云 鐘 原

(1. 北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 牡丹國(guó)際研究院 北京 100083； 2.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院 南京 210037)

牡丹(PaeoniaSect.Moutan)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)落葉灌木，是中國(guó)的傳統(tǒng)名花和重要的藥用植物(Cheng， 2007)，近年來(lái)，牡丹又被視為一種優(yōu)質(zhì)的木本油料資源(Lietal.， 2015)。然而，牡丹繁殖主要采用分株和嫁接的方法，繁殖效率低、周期長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的規(guī)模化生產(chǎn)。微繁殖技術(shù)可在短期內(nèi)大量繁殖苗木，克服了傳統(tǒng)繁殖方法的缺陷，因此，建立牡丹微繁殖技術(shù)是其種苗規(guī)?；a(chǎn)的必然趨勢(shì)。

牡丹微繁殖技術(shù)研究始于1984年(李玉龍等， 1984)，迄今已初步建立了20多個(gè)品種的微繁殖技術(shù)體系，但在一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍存在問(wèn)題： 1) 已研究報(bào)道了鱗芽(萌蘗芽、腋芽、花芽)和幼嫩莖段作為外植體的培養(yǎng)效果(孔祥生等， 1998； 李萍， 2007； 孟清秀等， 2011； 王蒙蒙等， 2018)，綜合比較發(fā)現(xiàn)鱗芽的污染率和誘導(dǎo)表現(xiàn)優(yōu)于幼嫩莖段，但污染率(20%～60%)仍較高，無(wú)法滿足高效生產(chǎn)需求； 2) 已通過(guò)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選、培養(yǎng)基調(diào)節(jié)以及環(huán)境條件控制等方面的探索，成功構(gòu)建了‘正午’、‘烏龍捧盛’、‘錦袍紅’牡丹等40多個(gè)品種的增殖培養(yǎng)體系，但增殖系數(shù)較低、試管苗質(zhì)量較差(Wenetal.， 2020)，且目前廣泛使用的植物組織培養(yǎng)傳統(tǒng)光源——熒光燈，其光效低、能耗大、成本高； 3) 已通過(guò)生長(zhǎng)素篩選、生根方式改良、培養(yǎng)環(huán)境調(diào)節(jié)等途徑，構(gòu)建了牡丹試管苗兩步生根技術(shù)體系(Bouzaetal.，1994； Berutoetal.， 2007； 文書(shū)生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)，組培苗生根率因品種而異(30%～100%)，且生根培養(yǎng)過(guò)程需更換培養(yǎng)基、流程復(fù)雜、成本高； 4) 移栽成活率低是制約牡丹微繁殖技術(shù)應(yīng)用的又一瓶頸問(wèn)題，這主要是由于生根試管苗質(zhì)量差(生長(zhǎng)勢(shì)弱、平均根數(shù)少)，且基部易產(chǎn)生大量愈傷組織，致使其移栽適應(yīng)力較低(張穎星， 2008； 邱金梅， 2010； 王新等， 2016)。總之，目前牡丹微繁殖仍存在啟動(dòng)培養(yǎng)污染嚴(yán)重，增殖效率低、能耗高，生根步驟復(fù)雜、生根苗質(zhì)量差，移栽成活率低等突出問(wèn)題(Wenetal.， 2020)，如何開(kāi)展優(yōu)化研究推進(jìn)該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用是牡丹良種快繁的迫切需求。

‘正午’牡丹(P.×lemoinei‘High Noon’)是美國(guó)著名育種家Sunders于1952年育出的一個(gè)亞組間雜種(P.delavayi×P.suffruticosa)(Wister， 1995)，花黃色呈荷花型，一年可多次開(kāi)花，適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)與應(yīng)用前景廣闊(圖1A)。本課題組前期已建立了該品種的微繁殖技術(shù)體系(文書(shū)生等， 2016； Wenetal.， 2016a)，但與其他牡丹優(yōu)良品種的微繁殖一樣，該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用仍面臨上述一系列問(wèn)題。鑒于此，本研究在已有工作基礎(chǔ)上(文書(shū)生等， 2016； Wenetal.， 2016a)，通過(guò)對(duì)不同外植體啟動(dòng)培養(yǎng)效果的比較、增殖培養(yǎng)階段LED(light-emitting diodes，發(fā)光二極管)光源的應(yīng)用以及生根方式的改進(jìn)等，優(yōu)化了‘正午’牡丹的微繁殖技術(shù)體系。研究結(jié)果不僅能夠?yàn)樵撈贩N的種苗規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐，還可為其他牡丹優(yōu)良品種微繁殖技術(shù)體系的建立提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 初代培養(yǎng)

供試材料為牡丹品種‘正午’，早春取萌蘗芽、腋芽和黃化嫩莖為外植體，取材母株健壯、無(wú)病蟲(chóng)害。其中，萌蘗芽和腋芽取自鷲峰國(guó)家森林公園牡丹研究基地露地生長(zhǎng)的母株，黃化嫩莖取自基地溫室盆栽的‘正午’牡丹經(jīng)暗處理[2012年2—4月，(24±1)℃暗處理]后萌發(fā)的嫩莖。按照李萍(2007)構(gòu)建的方法對(duì)材料進(jìn)行表面滅菌，然后將鱗芽用滅菌的刀和鑷子剝除芽鱗、切除幼葉，并將黃化嫩莖切割成含1～2個(gè)葉腋的小莖段，再將處理后的外植體接種于初代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為WPM(CaCl2加倍)+BA 0.5 mg·L-1+GA30.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。

培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度32.4 μmol·m-2s-1(熒光燈)，光照周期每天14 h(以下增殖和生根試驗(yàn)若無(wú)特殊說(shuō)明，培養(yǎng)條件與此相同)。培養(yǎng)50天后，統(tǒng)計(jì)不同外植體啟動(dòng)培養(yǎng)的污染率、褐化率和存活率，并采用黃化嫩莖培養(yǎng)獲得的叢生芽開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)。

1.2 增殖培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)末期切取芽叢上莖長(zhǎng)≥1.0 cm的健壯單芽作為試驗(yàn)材料，切除其葉片后接種于增殖培養(yǎng)基，即WPM [3倍Ca(NO3)2·4H2O]+meta-topolin 5 μmol·L-1+GA31.5 μmol·L-1+檸檬酸 0.12 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。其中meta-topolin是一種新型細(xì)胞分裂素，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)‘正午’牡丹試管苗增殖的促進(jìn)作用與BA相當(dāng)，且后期生根率和移栽成活率更高(Wenetal.， 2016b)。試驗(yàn)分2步： 1)光照強(qiáng)度為30 μmol·m-2s-1，設(shè)不同LED紅藍(lán)光質(zhì)配比5組，以熒光燈為對(duì)照(表1)，篩選最佳LED紅光(R)和藍(lán)光(B)光質(zhì)配比； 2)以試驗(yàn)1)結(jié)果為基礎(chǔ)(70%R+30%B)，設(shè)不同LED光照強(qiáng)度處理(30，50，70，90 μmol·m-2s-1)，以篩選70%R+30%B LED光質(zhì)配比條件下的最佳光照強(qiáng)度，從而建立增殖培養(yǎng)的最佳LED光照培養(yǎng)體系。增殖培養(yǎng)繼代周期為35天，培養(yǎng)末期統(tǒng)計(jì)不同處理的增殖系數(shù)(莖長(zhǎng)≥1.0 cm芽數(shù))、莖長(zhǎng)、葉片數(shù)和鮮質(zhì)量。試驗(yàn)所用LED光源為飛利浦公司生產(chǎn)，紅藍(lán)燈珠交錯(cuò)分布，光質(zhì)均勻，采用LI-1500輻射照度測(cè)量?jī)x和LI-190R光合有效輻射傳感器(美國(guó)LI-COR公司)測(cè)定組培架上方的光合有效輻射值，調(diào)至試驗(yàn)所需光質(zhì)和光照強(qiáng)度。每個(gè)處理接種18個(gè)單芽，重復(fù)3次。

表1 LED光處理的光質(zhì)和光照強(qiáng)度①Tab.1 Qualities and intensities of LED light in treatments

1.3 生根培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)末期切取芽叢上莖長(zhǎng)≥1.0 cm的健壯單芽(保留全部葉片)進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)20天(圖1E)(文書(shū)生等， 2016)，再將單芽(保留1～2片葉)轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)(圖1F)： 1)一步生根： 生根培養(yǎng)基為1/2 MS(CaCl2加倍)+IBA 1.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1(Wenetal.， 2016a)，pH5.8，培養(yǎng)基中附加不同濃度VB2(0、1、5、10、15 mg·L-1)，先置于黑暗條件下培養(yǎng)30天以誘導(dǎo)根原基，再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)20天促進(jìn)根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。2)兩步生根： 分為根誘導(dǎo)和根形成2個(gè)階段，即試管苗先于不含VB2的培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)30天(培養(yǎng)基同上述一步生根)以誘導(dǎo)根原基，然后轉(zhuǎn)入根形成培養(yǎng)基1/2 MS(CaCl2加倍)+活性炭 4.0 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1(Wenetal.， 2016a)，pH6.2，光照培養(yǎng)20天。在上述一步、兩步生根法的根誘導(dǎo)階段(前30天)，皆先將試管苗置于4 ℃條件下暗培養(yǎng)8天，然后轉(zhuǎn)入(24±1)℃的條件下暗培養(yǎng)(Berutoetal.， 2007)。每個(gè)處理接種30株無(wú)根試管苗，重復(fù)3次。生根培養(yǎng)50天后，統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、根數(shù)和根長(zhǎng)，并評(píng)價(jià)試管苗基部的愈傷組織等級(jí)。

1.4 馴化移栽

將生根試管苗置于4 ℃冰箱中低溫暗處理30天解除休眠(Bouzaetal.，1992； 1994)； 然后，轉(zhuǎn)至室溫下瓶?jī)?nèi)煉苗1周； 分別取80株一步生根(1.0 mg·L-1VB2)與兩步生根的試管苗，根據(jù)生根質(zhì)量、莖葉狀況以及基部愈傷組織大小將其分為3個(gè)質(zhì)量等級(jí)(一級(jí)苗： 根數(shù)≥2條，莖葉發(fā)育良好，無(wú)莖尖壞死，基部愈傷組織極少； 二級(jí)苗： 根數(shù)1～2條，莖發(fā)育良好，葉發(fā)黃，基部膨大，有輕微愈傷組織； 三級(jí)苗： 根數(shù)1條，莖上部無(wú)葉，基部嚴(yán)重愈傷化，根從愈傷組織發(fā)出)，分別移栽到8 cm×8 cm×9 cm(長(zhǎng)×寬×高)的塑料花盆，基質(zhì)為經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，40 min)的珍珠巖︰蛭石︰草炭土(體積比1∶1∶1)。移栽苗置于人工氣候室管理： 溫度(20±1)℃，濕度70%，光照強(qiáng)度32.4 μmol·m-2s-1，光照周期每天14 h，移栽60天后，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。第2年，將組培苗轉(zhuǎn)入溫室生長(zhǎng)，進(jìn)行正常的水肥管理。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA 分析并利用LSD法檢驗(yàn)差異顯著性(P≤0.05)，其中生根率和移栽成活率采用反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行上述分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對(duì)初代培養(yǎng)的影響

在啟動(dòng)培養(yǎng)條件下，不同類型外植體的表現(xiàn)存在顯著差異(表2)。黃化嫩莖的污染率最低(19.59%)，萌蘗芽次之(32.79%)，腋芽最高(44.71%)。3種外植體褐化均較輕，其中黃化嫩莖幾乎不褐化。黃化嫩莖的存活率最高(80.41%)，萌蘗芽次之(64.75%)，腋芽最低(52.94%)。因此，與鱗芽外植體(萌蘗芽和腋芽)相比，黃化嫩莖在啟動(dòng)培養(yǎng)中污染率更低、成活率更高，且不發(fā)生褐化(圖1B、C)。

表2 外植體類型對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響①Tab.2 Effects of explant types on initial culture

圖1 優(yōu)化的‘正午’牡丹微繁殖技術(shù)Fig. 1 An optimized protocol for the micropropagation of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’A:‘正午’牡丹; B: 啟動(dòng)培養(yǎng)10 d后萌動(dòng)的鱗芽外植體; C: 啟動(dòng)培養(yǎng)10 d后萌動(dòng)的黃化嫩莖外植體; D: 試管苗于最佳LED光照培養(yǎng)條件下(光質(zhì)配比70%紅光+30%藍(lán)光、光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1)增殖培養(yǎng)3代獲得的叢生芽; E: 復(fù)壯培養(yǎng)20 d后的試管苗; F: 根誘導(dǎo)培養(yǎng)的試管苗; G: 一步生根法(IBA 1.0 mg·L-1，VB2 1.0 mg·L-1)獲得的生根苗; H: 移栽后于人工氣候室生長(zhǎng)3個(gè)月的組培苗; I: 移栽后第2年于溫室正常生長(zhǎng)的組培苗。A: Flowering plant of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’; B: Scale bud after 10 days of initial culture; C: Etiolated shoot after 10 days of initial culture; D: The shoot cluster after 3 subcultures under the optimal LED illumination(light quality 70% Red+30% Blue, light intensity 50 μmol·m-2s-1); E: Shoots obtained after 20 days of rejuvenation culture; F: Shoots in root induction culture; G: Rooted shoots obtained by one-step rooting method(IBA 1.0 mg·L-1, VB2 1.0 mg·L-1); H: Plantlets grown in artificial climate chamber after three months of ex vitro establishment; I: Plantlets grown in greenhouse after two year of ex vitro establishment.

2.2 LED光照培養(yǎng)體系的建立

2.2.1 紅藍(lán)光質(zhì)配比篩選 適宜紅藍(lán)光質(zhì)配比的LED光源可以顯著促進(jìn)‘正午’牡丹試管苗的生長(zhǎng)，但對(duì)增殖無(wú)顯著促進(jìn)作用(圖2、圖3)。100%紅光(R)處理試管苗的增殖系數(shù)和莖長(zhǎng)最大，且顯著高于熒光燈對(duì)照，但其莖葉白化、細(xì)長(zhǎng)，生長(zhǎng)不良； 100%藍(lán)光(B)處理試管苗莖葉深綠、生長(zhǎng)正常，但增殖系數(shù)以及各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)與熒光燈對(duì)照均無(wú)顯著差異； LED紅藍(lán)光質(zhì)混合處理顯著提高了試管苗的莖長(zhǎng)和葉片數(shù)，但其增殖系數(shù)和鮮質(zhì)量與熒光燈對(duì)照無(wú)顯著差異，其中70% R+30% B處理試管苗的莖長(zhǎng)(1.69 cm)和葉片數(shù)(8.74)均顯著高于對(duì)照，且整體生長(zhǎng)健壯，因此該處理為‘正午’牡丹增殖培養(yǎng)的最佳LED紅藍(lán)光質(zhì)配比。

圖2 LED光質(zhì)配比對(duì)‘正午’牡丹試管苗增殖和生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effects of LED light quality on in vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差; 不同小寫(xiě)字母表示在P ≤ 0.05水平差異顯著; W、R和B分別表示熒光燈、紅光和藍(lán)光。The data are means ± standard error; different letters indicate significant differences at P ≤ 0.05; W, R and B represent fluorescent lamp, LED light of red and blue, respectively.

圖3 不同紅藍(lán)光質(zhì)配比條件下‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長(zhǎng)表現(xiàn)Fig. 3 In vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’cultured under different light qualityA: W; B: 100%R; C: 80%R+20%B; D: 70%R+30%B; E: 60%R+40%B; F: 100%B. W、R和B分別表示熒光燈、紅光和藍(lán)光。W, R and B represent fluorescent lamp, LED light of red and blue, respectively.

2.2.2 光照強(qiáng)度篩選 在LED光質(zhì)試驗(yàn)篩選的最佳紅藍(lán)光質(zhì)配比(70% R+30% B)條件下設(shè)置不同光照強(qiáng)度處理，結(jié)果顯示，光照強(qiáng)度對(duì)試管苗的增殖和生長(zhǎng)均存在顯著影響(圖4、圖5)。增殖系數(shù)、葉片數(shù)均隨著光照強(qiáng)度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2s-1時(shí)，試管苗的增殖系數(shù)和葉片數(shù)均達(dá)到最大值，且顯著高于30 μmol·m-2s-1時(shí)； 適當(dāng)提高光照強(qiáng)度有利于提高試管苗的鮮質(zhì)量，50～90 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度處理的試管苗鮮質(zhì)量顯著高于30 μmol·m-2s-1； 然而，提高光照強(qiáng)度對(duì)莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)存在抑制，90 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度處理的試管苗莖長(zhǎng)顯著低于30 μmol·m-2s-1。因此，在紅藍(lán)光質(zhì)配比為70% R+30% B條件下，‘正午’牡丹增殖培養(yǎng)的最佳光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2s-1，在該條件下試管苗繼續(xù)培養(yǎng)3代增殖和生長(zhǎng)狀況良好(圖1D)。

圖4 光照強(qiáng)度對(duì)‘正午’牡丹試管苗增殖和生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of illumination intensity on the in vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 不同小寫(xiě)字母表示在P≤0.05水平差異顯著。The data are means ± standard error; different letters indicate significant differences at P ≤ 0.05.

圖5 不同光照強(qiáng)度條件下‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長(zhǎng)表現(xiàn)Fig. 5 In vitro shoot multiplication and growth of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’cultured under different light intensityA: 30 μmol· m-2 s-1; B: 50 μmol· m-2 s-1; C: 70 μmol· m-2 s-1; D: 90 μmol· m-2 s-1.

2.3 一步生根體系的建立

通過(guò)VB2濃度篩選和生根光照條件控制，構(gòu)建牡丹試管苗一步生根技術(shù)(表3)。結(jié)果顯示，在一步生根法中，不添加VB2處理的試管苗生根率最低(50.64%)，根數(shù)最少(1.09)，根長(zhǎng)最短(1.21 cm)，且試管苗基部愈傷組織較多(等級(jí)2)。1.0～5.0 mg·L-1VB2處理的組培苗的生根率(71.07%～74.23%)和根數(shù)(3.17～3.34條)與兩步生根法(生根率77.21%，根數(shù)2.84條)無(wú)顯著差異，且試管苗基部愈傷組織極少(等級(jí)1)。但是，進(jìn)一步提高VB2濃度至10～15 mg·L-1會(huì)抑制生根，15 mg·L-1VB2處理的試管苗的生根率、根數(shù)和根長(zhǎng)皆顯著低于兩步生根法。因此，在生根培養(yǎng)基含1.0 mg·L-1IBA條件下，通過(guò)添加1～5 mg·L-1VB2以及培養(yǎng)過(guò)程中的光照條件控制(先暗培養(yǎng)30天，再光照培養(yǎng)20天)可以實(shí)現(xiàn)牡丹試管苗的一步生根，其生根效果與兩步生根法相當(dāng)，且生根苗基部愈傷組織更少，有利于移栽成活(圖1G)。

表3 VB2對(duì)‘正午’牡丹試管苗生根的影響①Tab.3 Effects of VB2 on the in vitro rooting Paeonia× lemoinei ‘High Noon’

2.4 馴化移栽

分別調(diào)查一步和兩步生根處理試管苗移栽成活情況，發(fā)現(xiàn)試管苗質(zhì)量與移栽成活率密切相關(guān)，一級(jí)苗成活率最高，移栽60天后成活率分別為85.00%(一步生根)和82.00%(兩步生根)，但二、三級(jí)苗移栽成活率較低，尤其是三級(jí)苗僅10%左右成活，且觀察發(fā)現(xiàn)莖基部高度膨大的愈傷組織易腐爛導(dǎo)致全株死亡(表4)。比較觀察2種生根方法獲得的生根苗質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)一步生根法獲得的生根苗基部愈傷組織較少，生根苗質(zhì)量更佳，一級(jí)苗比例比兩步生根法提高了12.5%，且試管苗移栽后可以正常生長(zhǎng)(表4； 圖1H、I)。

表4 生根方式對(duì)‘正午’牡丹試管苗移栽成活率的影響Tab.4 Effects of rooting method on transplanting survival rate of Paeonia× lemoinei ‘High Noon’plantlets

3 討論

3.1 黃化嫩莖是適宜的牡丹微繁殖外植體

牡丹微繁殖通常以休眠鱗芽為外植體，但最佳取材時(shí)間僅限于早春鱗芽萌動(dòng)前，且滅菌污染率較高(Wenetal.， 2020)。本研究比較了黃化嫩莖與2種鱗芽(萌蘗芽、腋芽)的啟動(dòng)培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)黃化嫩莖污染率較低(19.59%)，存活率較高(80.41%)，是一種優(yōu)于鱗芽的外植體來(lái)源。然而，孔祥生等(1998)在牡丹‘洛陽(yáng)紅’(P.suffruticosa‘Luoyang Hong’)中得出了完全相反的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)鱗芽外植體滅菌成活率(63.5%～80.0%)顯著高于嫩莖(11.7%)。這可能與外植體預(yù)處理有關(guān)，前人研究采用的是大田植株早春萌發(fā)的嫩莖，本研究采用的黃化嫩莖在溫室暗處理(黃化)過(guò)程中降低了環(huán)境污染，且在滅菌環(huán)節(jié)能夠與滅菌劑充分接觸從而提高了滅菌效率，而黃化處理可降低外植體滅菌污染率在芍藥(P.lactiflora)中也有報(bào)道(王吉鳳等， 2012)。因此，外植體類型和預(yù)處理都是影響牡丹啟動(dòng)培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，與萌蘗芽和腋芽相比，黃化嫩莖更適宜用作牡丹微繁殖的外植體。綜合來(lái)看，采用黃化嫩莖進(jìn)行離體培養(yǎng)打破了牡丹微繁殖只能在早春取鱗芽外植體的限制，其滅菌染菌率低于鱗芽，在工廠化生產(chǎn)方面具備更高的可行性和生產(chǎn)效率。

3.2 LED光照培養(yǎng)可促進(jìn)牡丹試管苗的增殖和生長(zhǎng)

光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，光質(zhì)和光照強(qiáng)度對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和生理代謝等均有重要調(diào)控作用(高榮孚等， 2002)。紅光和藍(lán)光是植物生長(zhǎng)必需的2種光譜，也是光合色素吸收的主要光譜(Macedoetal.， 2011； 馬宏等， 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)單一紅光(R)或藍(lán)光(B)無(wú)法滿足‘正午’牡丹試管苗的增殖培養(yǎng)需求，其中紅光有利于試管苗的腋芽萌發(fā)和莖的伸長(zhǎng)，但100% R處理的試管苗莖葉白化、細(xì)長(zhǎng)，生長(zhǎng)不良，這與在非洲菊(Gerberajamesonii)(孫翊等， 2017)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(Diercketal.， 2017)等植物中的研究結(jié)論一致； 100% B處理試管苗的莖葉深綠、生長(zhǎng)正常，但增殖系數(shù)和各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)與熒光燈對(duì)照均無(wú)顯著差異，這可能是由于藍(lán)光促進(jìn)了葉綠素合成的原因(孫翊等， 2017； 項(xiàng)蕾蕾等， 2020)。進(jìn)一步嘗試不同光質(zhì)配比發(fā)現(xiàn)，適宜配比的紅藍(lán)復(fù)合光(70% R+30% B)能夠疊加紅藍(lán)單色光的優(yōu)點(diǎn)，可以顯著促進(jìn)‘正午’牡丹試管苗的生長(zhǎng)(葉片數(shù)、莖長(zhǎng))，但對(duì)增殖無(wú)顯著促進(jìn)作用。然而，這與牡丹品種‘烏龍捧盛’(P.suffruticosa‘Wulong Pengsheng’)(75% R+25% B)、‘洛陽(yáng)紅’(75% R+25% B)以及‘胡紅’(P.suffruticosa‘Hu Hong’)(50% R+50% B)(岳嵐， 2008)試管苗的最佳光質(zhì)配比不一致，說(shuō)明不同牡丹品種對(duì)紅藍(lán)光的需求量存在一定差異，LED光源在牡丹微繁殖中的應(yīng)用需根據(jù)品種篩選最佳的紅藍(lán)光質(zhì)配比。此外，光照強(qiáng)度也是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要光照參數(shù)，光照強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)過(guò)弱都會(huì)抑制光合作用，從而限制植物生長(zhǎng)(尚三娟等， 2020)。目前，牡丹增殖培養(yǎng)的常用光照強(qiáng)度為30 μmol·m-2s-1，本研究發(fā)現(xiàn)在LED光質(zhì)配比70%R+30%B條件下，適當(dāng)提高光照強(qiáng)度可以顯著促進(jìn)試管苗的增殖和生長(zhǎng)，其中50 μmol·m-2s-1為最佳處理，其增殖系數(shù)(3.79)、葉片數(shù)(15.75)和鮮質(zhì)量(410.21 mg)均顯著高于30 μmol·m-2s-1處理的相關(guān)指標(biāo)，這與牡丹‘烏龍捧盛’試管苗的最佳光照強(qiáng)度(閆新房， 2009)一致。

綜上所述，與傳統(tǒng)熒光燈光源(30 μmol·m-2s-1)相比，適宜的LED光源(光質(zhì)配比70%R+30%B，光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1)可以顯著促進(jìn)‘正午’牡丹試管苗的增殖和生長(zhǎng)，將增殖系數(shù)由2.15提高到3.79，且試管苗生長(zhǎng)健壯，從而優(yōu)化了微繁殖技術(shù)的增殖培養(yǎng)環(huán)節(jié)。然而，目前LED光源在牡丹微繁殖中的應(yīng)用仍處于技術(shù)探索階段，對(duì)于光質(zhì)和光照強(qiáng)度調(diào)控牡丹試管苗增殖和生長(zhǎng)的內(nèi)在機(jī)理還有待進(jìn)一步探索。

3.3 一步直接生根法是牡丹試管苗生根的有效技術(shù)

IBA是有效誘導(dǎo)牡丹不定根發(fā)生的常用生長(zhǎng)素，前人比較了不同生根方式(一步生根法、兩步生根法)的生根效果，發(fā)現(xiàn)兩步生根法生根率較高，即先將試管苗置于含IBA的培養(yǎng)基暗培養(yǎng)以誘導(dǎo)根原基，再轉(zhuǎn)至不含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)以促進(jìn)不定根伸長(zhǎng)(Bouzaetal.， 1994； Berutoetal.， 2007)。兩步生根法成功的主要原因在于根原基誘導(dǎo)需要生長(zhǎng)素刺激，而后續(xù)不定根伸長(zhǎng)不需要高濃度生長(zhǎng)素(王清民等， 2006； 賀丹等， 2011； 尚文倩等， 2021)，此時(shí)若繼續(xù)給予高濃度生長(zhǎng)素反而會(huì)對(duì)不定根伸長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，因此兩步生根法被廣泛應(yīng)用于核桃(Juglansregia)(裴東等， 2002； 樊靖等， 2009)、柿樹(shù)(Diospyroskaki)(劉一鳳， 2017)以及梨(Pyruscommunis)(苗冉冉等， 2019)等難生根的木本植物中。目前，兩步生根法是牡丹試管苗生根的主要方式(文書(shū)生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)，但培養(yǎng)過(guò)程需更換培養(yǎng)基，流程復(fù)雜、成本高，并不利于生產(chǎn)推廣。

有研究發(fā)現(xiàn)，IBA和VB2在黑暗條件下性質(zhì)基本穩(wěn)定，但在光照條件下均會(huì)逐漸分解； 培養(yǎng)基中二者共存時(shí)，VB2在光照下的分解速度不受IBA的影響，而IBA在光照下的分解速度卻因VB2的存在而加快(Fossardetal.， 1974； Drewetal.， 1991； 1993)。據(jù)此本研究構(gòu)建了新型牡丹試管苗一步生根技術(shù)，即試管苗先于附加IBA 1.0 mg·L-1和VB21.0～5.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)根原基30天，再轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)20天利用VB2加速分解IBA以促進(jìn)不定根伸長(zhǎng)。該方法所得生根率(71.07%～74.23%)和根數(shù)(3.17～3.34條)與兩步生根法(生根率77.21%，根數(shù)2.84條)無(wú)顯著差異，這與番木瓜(Caricapapaya)(Drewetal.， 1991)中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明利用IBA和VB2的光反應(yīng)特性可以實(shí)現(xiàn)牡丹試管苗高效一步生根，這可能是由于VB2可以充當(dāng)生長(zhǎng)素光氧化反應(yīng)的光受體，繼而促進(jìn)生長(zhǎng)素的分解，從而避免了生長(zhǎng)素對(duì)不定根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的抑制作用(Galstonetal.， 1949a； 1949b； Gorstetal.， 1983)。此外，本研究中一步生根法(VB21.0～5.0 mg·L-1)獲得的生根苗基部愈傷組織較少，更易于移栽成活，這主要是由于試管苗基部愈傷組織易造成根與莖的維管組織連接不暢(賀丹等， 2011； 賈文慶等， 2013)，且移栽后愈傷組織極易腐爛導(dǎo)致植株死亡(張穎星， 2008； 邱金梅， 2010； 王新等， 2016)。本研究建立的一步生根法與前人報(bào)道的牡丹一步生根法(Bouzaetal.， 1994； Berutoetal.， 2007)相比，其通過(guò)VB2的使用以及培養(yǎng)過(guò)程的光照條件控制大幅提高了生根率和生根質(zhì)量； 與牡丹兩步生根法(文書(shū)生等， 2016； Wenetal.， 2016a； 2016b； 王新等， 2016； Shangetal.， 2017； 王蒙蒙等， 2018)相比，其操作流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、移栽成活率高，可以在牡丹微繁殖中推廣應(yīng)用。然而，鑒于不同牡丹品種不定根誘導(dǎo)適宜的IBA濃度存在較大差異，其對(duì)應(yīng)VB2處理濃度也需進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，本研究報(bào)道的IBA和VB2濃度僅供參考。

4 結(jié)論

本研究圍繞牡丹微繁殖過(guò)程中啟動(dòng)、增殖、生根、移栽階段存在的突出問(wèn)題，對(duì)‘正午’牡丹微繁殖技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化： 發(fā)掘了優(yōu)于鱗芽的外植體類型——黃化嫩莖，能夠有效降低污染、提高啟動(dòng)培養(yǎng)的成活率； 建立了LED光照培養(yǎng)體系(光質(zhì)配比70%紅光+30%藍(lán)光，光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1)，該光照條件顯著促進(jìn)了試管苗的增殖和生長(zhǎng)； 通過(guò)在生根培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1IBA和1～5 mg·L-1VB2，結(jié)合培養(yǎng)過(guò)程光照條件控制(暗培養(yǎng)30天后再光照培養(yǎng)20天)，建立了高效的牡丹試管苗一步生根法，在不降低生根率的前提下，提高了生根苗質(zhì)量與移栽成活率。本研究所建立和優(yōu)化的‘正午’牡丹微繁殖技術(shù)體系，不僅能夠促進(jìn)該品種種苗規(guī)?；a(chǎn)，還可以為其他牡丹品種的微繁殖研究提供參考和借鑒。