四川山胡椒葉綠體基因組特征及山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育*

劉 潮 唐利洲 韓利紅

(曲靖師范學院生物資源與食品工程學院 云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室 云南省高校特色果酒技術創(chuàng)新與應用工程研究中心 曲靖 655011)

四川山胡椒(Linderasetchuenensis)為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)常綠灌木，多生于山坡路旁及疏林中，分布于我國四川、貴州等地(http:∥www.iplant.cn/frps)。四川山胡椒葉片提取物香精油對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均具有明顯的抑制作用(Weietal.， 2016)，其葉片中提取的多種化合物具有抗腫瘤活性(袁娟娟， 2018； 張嘉穗， 2016)。

葉綠體是質(zhì)體的一種，為綠色植物光合作用的場所，具有相對獨立的遺傳系統(tǒng)。陸生植物葉綠體基因組大小范圍為107～218 kb，具有高度保守的四分體結構，包括2個反向重復區(qū)(inverted repeats，IR)，以及被IR分隔的大單拷貝區(qū)(large single copy，LSC)和小單拷貝區(qū)(small single copy，SSC)(Danielletal.， 2016)。葉綠體基因組編碼120～130個基因，主要參與光合作用、基因轉錄和翻譯(Danielletal.， 2016)。目前多個山胡椒屬物種葉綠體基因組已被相繼報道(Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019)。完整的葉綠體基因組序列對于了解植物相近類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關系和物種進化具有重要價值(Danielletal.， 2016)，基于高通量測序的系統(tǒng)進化基因組學研究，成為全面理解生物進化的重要工具(Songetal.， 2020)。葉綠體基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)很好地解決了樟科等多種植物類群的系統(tǒng)發(fā)育關系(Songetal.， 2017； 2020； Zhaoetal.， 2020； Xieetal.， 2020)。密碼子使用偏性可以反映葉綠體基因組進化特征及其影響因素，在基因表達中起重要作用(Boeletal.， 2016)。葉綠體基因組條形碼可用于品種鑒定和種質(zhì)資源保護，物種特有的重復序列可以作為一種潛在的遺傳多樣性標記。葉綠體基因組結構特征和進化研究，對于分析物種遺傳背景和系統(tǒng)發(fā)育關系都具有重要的意義。

四川山胡椒具有重要的潛在藥用價值，然而關于四川山胡椒物種遺傳多樣性、進化和發(fā)育方面的研究較少，未見葉綠體基因組方面的報道。本研究首次通過高通量測序技術獲得四川山胡椒葉綠體基因組序列，并對葉綠體基因組序列重復、密碼子使用偏性，山胡椒屬物種葉綠體基因組高變區(qū)和進化發(fā)育關系進行分析，以期為四川山胡椒的遺傳背景、進化發(fā)育和種質(zhì)資源保護提供借鑒。

1材料與方法

1.1 試驗材料 四川山胡椒采自江蘇省南京中山植物園(118°50′3.19″E，32°03′9.67″N)，新鮮葉片置于硅膠中保存。標本存放于中國科學院西雙版納熱帶植物園(標本號XTBG-BRG-SY36159)。用改良的CTAB法從葉組織中提取四川山胡椒總DNA(Doyleetal.， 1987)，構建測序文庫?；贗llumina Genome Analyzer Hiseq 2000測序平臺進行葉綠體基因組測序。

1.2 四川山胡椒葉綠體基因組組裝與注釋 使用GetOrganelle軟件(Jinetal.， 2020)組裝獲得完整葉綠體基因組。四川山胡椒完整葉綠體基因組數(shù)據(jù)上傳LCGDB 數(shù)據(jù)庫(http:∥lcgdb.wordpress.com)，訪問號LAU00108。以山胡椒(Linderaglauca)葉綠體基因組(登錄號MG581443)為參考，利用GeSeq(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)進行基因組注釋。利用OGDRAW軟件(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制葉綠體基因組圖譜(Greineretal.， 2019)。

1.3 四川山胡椒葉綠體密碼子使用偏性分析 利用CodonW 1.4.2軟件分析四川山胡椒葉綠體基因組編碼基因的有效密碼子數(shù)(effective number of codon，ENC)以及鳥嘌呤(guanine)和胞嘧啶(cytosine)含量(GC)，通過EMBOSS在線網(wǎng)站(http:∥emboss.toulouse.inra.fr/)的cusp軟件分析相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)。分別選取ENC值較小和較大的10%基因作為高表達基因(high expression gene，HEG)和低表達基因(low expression gene，LEG)，計算ΔRSCU值(ΔRSCU=RSCU高表達-RSCU低表達)。密碼子RSCU>1則為高頻密碼子，同時滿足ΔRSCU≥0.08則為最優(yōu)密碼子。

1.4 四川山胡椒葉綠體序列重復分析 通過REPuter軟件(Kurtzetal.， 2001)分析序列重復，最小重復長度為30 bp，序列同源性90%，Hamming距離3，分析了互補(complementary)、正向(forward)、反向(reverse)和回文(palindromic)重復。利用MISA在線工具檢測SSR(Beieretal.， 2017)，分析的最小閾值為單核苷酸重復次數(shù)8，二核苷酸重復次數(shù)4，三核苷酸重復次數(shù)4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數(shù)均為3。

1.5 山胡椒屬核苷酸多樣性分析 通過MAFFT v. 7.450(Katohetal.， 2019)對山胡椒屬物種葉綠體基因組序列進行多序列比對，利用DnaSP 6.0計算核苷酸多態(tài)性值(Rozasetal.， 2017)，設置搜索窗口長度為600 bp，步長為200 bp，使用R程序繪圖。

1.6 山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI和LCGDB數(shù)據(jù)庫下載30種山胡椒屬和樟屬(Cinnamomum)物種的葉綠體基因組序列，其中三椏烏藥(Linderaobtusiloba，LAU00057)序列由LCGDB數(shù)據(jù)庫下載，其他物種序列由NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫下載。利用四川山胡椒和28個山胡椒屬物種的葉綠體基因組序列，以樟(Cinnamomumcamphora)和沉水樟(C.micranthum)為外類群，使用MAFFT v. 7.450進行多序列比對，通過IQ-TREE v. 2.1.1軟件(Minhetal.， 2020)基于最大似然法(maximum likelihood，ML)構建系統(tǒng)進化樹，建樹模型為K3Pu+F+R3，步長值為1 000。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組結構特征 四川山胡椒葉綠體基因組全長為152 851 bp(圖1)，與其他山胡椒屬物種大小相當(Tianetal.， 2019； Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018)，呈典型的四分結構，LSC、SSC和IR區(qū)大小分別為93 742 bp、18 977 bp和20 066 bp。基因組總GC含量為39.15%，IR區(qū)GC含量最高(44.42%)，其次為LSC(37.94%)，SSC最低(33.95%)。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個基因，其中蛋白編碼基因81個，轉運RNA(tRNA)36個，核糖體RNA(rRNA)8個，13個基因為雙拷貝基因。

圖1 四川山胡椒葉綠體基因組結構Fig. 1 Complete chloroplast genome map of Lindera setchuenensis

2.2 葉綠體蛋白編碼基因密碼子偏性分析 四川山胡椒葉綠體蛋白編碼基因GC含量為39.13%，鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的出現(xiàn)頻率GC3s為27.96%，平均ENC值為49.11。蛋白編碼基因高頻密碼子有31個(表1)，其中13個以A結尾，16個以U(T)結尾，以G和C結尾的分別有1個。最優(yōu)密碼子有21個，其中9個以A結尾，11個以U(T)結尾，1個以G結尾。

表1 四川山胡椒葉綠體基因組相對同義密碼子使用度①Tab.1 Relative synonymous codon usage of genes in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.3 葉綠體基因組序列重復分析 四川山胡椒葉綠體基因組中共檢測到27對長序列重復(圖2)，長度30 bp的序列數(shù)目最多，位于IR、LSC和SSC上的數(shù)目分別為8、13和3，其次為33 bp的序列，分別有14和2個位于IR和LSC上。長序列重復中，正向重復最多，達24個(占44%)，其次為回文重復22個(占41%)，反向重復和互補重復分別為6個和2個，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復和回文重復中均占較高比例，30 bp重復多數(shù)位于LSC和IR上，33 bp重復多數(shù)位于IR上。

圖2 四川山胡椒葉綠體基因組序列重復Fig. 2 Repeats in the chloroplast genome of Lindera setchuenensisLSC、SSC和IR分別表示大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)和反向重復區(qū)，其后數(shù)值表示序列重復長度。LSC, SSC and IR represent large single copy, small single copy and inverted repeats, respectively, and the subsequent values represent the sequence repeat length.

四川山胡椒葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)13種類型共181個SSR位點(圖3)。其中，單堿基SSR數(shù)目最多，占SSR總數(shù)的71.27%，其次為雙堿基SSR，占20.44%。A/T類SSR占單堿基SSR的95.35%，AT/AT類堿基占雙堿基SSR的51.35%(圖3)。55%的SSR位于基因間區(qū)，29%位于編碼序列(coding sequence，CDS)上，15%位于內(nèi)含子區(qū)，僅有1%位于rRNA上(圖4)。

圖3 四川山胡椒葉綠體基因組SSR位點類型及數(shù)量Fig. 3 The types and number of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

圖4 四川山胡椒葉綠體基因組SSR 位點分布Fig. 4 The distribution of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.4 山胡椒屬序列突變熱點分析 序列突變熱點(mutational hotspots)又稱高變區(qū)(hyper-variable regions)，可為設計準確、穩(wěn)定而高效的分子標記和物種條形碼提供參考(Niuetal.， 2021)。使用DnaSP 6.0軟件分析了山胡椒屬核苷酸多態(tài)性位點(圖5)，序列比對總長度為156 450 bp，序列一致位點長度為150 149 bp，突變位點數(shù)為4 351，大約2.78%為多態(tài)性位點，核苷酸多樣性值范圍為0～0.019 79，平均值為0.004 08。鑒定的6個高變區(qū)中，3個位于LSC區(qū)(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個位于SSC區(qū)(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)，IR區(qū)沒有高變區(qū)，表明單拷貝區(qū)核苷酸多態(tài)性明顯高于IR區(qū)。

圖5 山胡椒屬葉綠體基因組序列核苷酸多態(tài)性分析Fig. 5 The nucleotide diversity(Pi) of chloroplast genome sequence of the genus Lindera

2.5 山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育分析 利用IQtree軟件使用最適模型K3Pu+F+R3構建的ML進化樹，展示了山胡椒屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關系(圖6)。山胡椒屬物種歸為5個聚類組： 聚類組1成員最多，為11個，其次是聚類組4，有8個成員，聚類組2和聚類組5分別有5個和4個成員，聚類組3僅有三椏烏藥1種。四川山胡椒與黑殼楠(Linderamegaphylla)、紅脈釣樟(L.rubronervia)、大果山胡椒(L.praecox)、綠葉甘橿(L.neesiana)、絨毛釣樟(L.floribunda)、山橿(L.reflexa)歸在聚類組4，與黑殼楠親緣關系最近。

圖6 基于最大似然法構建的山胡椒屬葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 The Maximum-likelihood tree of Lindera species based on analyses of the chloroplast genomes

3 討論

植物葉綠體基因組為了解葉綠體功能、細胞內(nèi)基因轉移、物種多樣性、植物資源保護和遺傳育種提供分子基礎(Danielletal.， 2016)。本研究對四川山胡椒葉綠體基因組進行測序、組裝和注釋，獲得了完整的葉綠體基因組數(shù)據(jù)。四川山胡椒葉綠體基因組大小為152 851 bp，具有典型的四分體結構，與之前公布的山胡椒屬物種一致(Zhaoetal.， 2018)。本研究以山胡椒葉綠體基因組(MG581443)為參考，對四川山胡椒葉綠體基因組進行注釋，發(fā)現(xiàn)四川山胡椒基因組共編碼125個基因，其中單拷貝基因112個，該結果與Zhao等(2018)和Tian等(2019)的注釋略有不同，這與基因組注釋時的參考基因組不同有關。

密碼子使用偏性是物種對環(huán)境的長期適應性進化的結果，受多種因素的共同影響(Duanetal.， 2021)。RSCU值反映了不同基因的密碼子使用模式，數(shù)值越高表示該密碼子使用頻率越高(Sharpetal.， 1987)。四川山胡椒葉綠體基因組總GC含量為39.15%，IR區(qū)GC含量明顯高于單拷貝區(qū)，蛋白編碼基因GC含量與葉綠體基因組接近，而GC3s明顯較低(27.96%)，這與山胡椒屬其他物種類似(Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019； Xiaoetal.， 2020)。31個高頻密碼子中以A/U(T)結尾的占94%，21個最優(yōu)密碼子中以A/U(T)結尾的占95%，這與其他植物葉綠體基因組密碼子使用偏性(Duanetal.， 2021)一致，表明葉綠體基因密碼子第3位堿基存在不對稱性，并表現(xiàn)出對A/U(T)的偏好性(Duanetal.， 2021； 鄭祎等， 2020； 周曉君等， 2020)。

序列重復廣泛存在于植物葉綠體基因組中，在基因表達和調(diào)控中起著重要作用，由于這些區(qū)域存在高度序列多態(tài)性，對于研究分子進化和遺傳多樣性以及開發(fā)植物育種所必需的分子標記具有重要意義(蔣明等， 2020； Zhengetal.， 2020； Zhuetal.， 2021)。四川山胡椒葉綠體基因組長序列重復中，正向重復和回文重復含量較高，30 bp序列重復主要分布在單拷貝區(qū)，33 bp序列重復主要分布在IR區(qū)?；蚪MSSR位點含有較高比例的A/T，其中單堿基SSR以A/T型為主，55%的SSR位于基因間區(qū)，與Tian等(2019)結果類似，SSR較高的A/T含量可能與葉綠體基因組A/T含量較高有關。豐富的回文序列可能為基因組提供一些二級結構，而單核苷酸重復序列可能比其他SSR提供了更多的系統(tǒng)發(fā)育信號?；蚪M中6個高變區(qū)均位于單拷貝區(qū)，其中3個位于LSC，3個位于SSC，高變區(qū)trnH-psbA、psbK-psbI、petA-psbJ、ccsA-ndhD、ycf1與Zhao等(2018)和Tian等(2019)研究結果一致，可作為山胡椒屬DNA條形碼用于物種鑒定。所篩選的多態(tài)性SSR和高變區(qū)可為山胡椒屬物種的鑒定和分子標記輔助育種提供參考。

山胡椒屬具有重要的經(jīng)濟和藥用價值。多個山胡椒屬物種葉綠體基因組的公布，為山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育研究提供了強有力的數(shù)據(jù)支撐。為了解四川山胡椒與山胡椒屬其他物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，本研究基于已公布的葉綠體基因組數(shù)據(jù)構建了山胡椒屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹。Zhao等(2018)將山胡椒屬分為2個或4個支系，本研究基于進化樹支持率將山胡椒屬分為5個聚類組，四川山胡椒分在聚類組4，與黑殼楠親緣關系最近，該結果與Tian等(2019)研究結果一致。根據(jù)崔鴻賓(1987)基于生物學性狀的分類，山胡椒屬分為5個組(Section)，本研究中聚類組1、聚類組2和聚類組3均屬于單系組，其中聚類組1物種屬于三出脈組(LinderaSectionDaphnidium)(除美國山胡椒未記錄外)，聚類組2屬于長梗組(LinderaSectionAperula)，聚類組3僅有三椏烏藥一種，屬于掌脈組(LinderaSectionPalminerviae)； 聚類組4為多系組，屬于山胡椒組(LinderaSectionLindera)、三出脈組、球果組(LinderaSectionSphaerocarpae)和杯托組(LinderaSectionCupuliformes)，聚類組5屬于山胡椒組和多蕊組(LinderaSectionPolyadenia)。分析表明，僅基于是否落葉、葉片或頂芽等生物學特征進行的山胡椒屬物種分類具有一定局限性，基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析對于明確山胡椒屬物種的系統(tǒng)演化具有重要的參考價值。

4 結論

本研究基于高通量測序技術，從頭測序并組裝了完整的四川山胡椒葉綠體基因組。該基因組呈典型的四分體結構，基因組全長為152 851 bp，LSC、SSC和IR區(qū)大小分別為93 742、18 977、20 066 bp。27對長序列重復中，正向重復最多，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復和回文重復均占較高比例。181個SSR位點中，單堿基SSR數(shù)目最多，多數(shù)SSR位于基因間區(qū)。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個基因，偏好以A或U(T)結尾的密碼子。6個高變區(qū)中，3個位于LSC區(qū)(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個位于SSC區(qū)(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)。系統(tǒng)發(fā)育關系上，山胡椒屬物種歸為5個聚類組，四川山胡椒與黑殼楠親緣關系最近。