高通量測序和數(shù)字PCR應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒非整倍體研究進展

陳桂芳 楊佳怡 高運華 王志棟 吳梟

（1.沈陽化工大學(xué)，遼寧沈陽 110142；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029）

胎兒染色體非整倍體是產(chǎn)前篩查檢測的主要內(nèi)容，進行早期產(chǎn)前篩查和診斷有利于優(yōu)生優(yōu)育。非整倍體產(chǎn)前檢測是采用無創(chuàng)、微創(chuàng)或有創(chuàng)的技術(shù)方法，在一定時間窗口期對孕婦進行檢查，以評估胎兒罹患染色體非整倍體疾病的風險或進一步確診［1］。傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法具有侵入性，通過羊膜穿刺、絨毛取樣以及臍靜脈穿刺取樣進行染色體核型分析，有潛在的胎兒流產(chǎn)或感染風險［2］，早孕期、中孕期常規(guī)產(chǎn)前篩查通過超聲檢查聯(lián)合血清學(xué)標記分析，同時結(jié)合孕婦年齡、孕周、體重以及是否存在糖尿病等多項臨床信息，以軟件計算風險值進行評估，但敏感度和特異性有限［3，4］。Lo等［5］于1997年在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cff-DNA），為胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）奠定了基礎(chǔ)。

2008 年，Lo等［6］驗證了基于孕婦血漿中的cff-DNA和大規(guī)?；蚪M測序進行胎兒染色體非整倍體檢測的可行性。目前，基于高通量測序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測已用于臨床篩查胎兒21-三體、18-三體以及13-三體綜合征，在高風險孕婦中表現(xiàn)出很高的靈敏度、特異性以及檢出率［7］。高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測會受到源于胎兒、母體、測序過程以及數(shù)據(jù)分析等多種因素的影響，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果［8］。早期，Lo等［9］和Fan等［10］先后證明單分子定量檢測技術(shù)可以用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體，但為可靠地檢測低豐度的cff-DNA，需要大量的PCR反應(yīng)。隨著微流控技術(shù)的引入，數(shù)字PCR（digital PCR，d PCR）技術(shù)表現(xiàn)出更高的檢測效率和靈敏度。已有研究表示，d PCR在染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測應(yīng)用中具有更直接、更快速和更具成本效益的發(fā)展?jié)摿Γ?1-13］。

本文將簡要介紹基于孕婦外周血游離DNA進行胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的研究進展，分析影響高通量測序無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測結(jié)果準確性的可能因素以及現(xiàn)有用于質(zhì)量控制的核酸標準物質(zhì)，并討論d PCR技術(shù)應(yīng)用于無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的原理和優(yōu)勢和最新研究進展。

1 染色體非整倍體檢測與無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的研究與發(fā)展

染色體非整倍體被定義為正常染色體的“重復(fù)”或“缺失”，可能導(dǎo)致早孕期胎兒流產(chǎn)，或者導(dǎo)致新生兒先天性缺陷、發(fā)育不良以及多器官功能異常，進行早期產(chǎn)前篩查和診斷有利于優(yōu)生優(yōu)育［1］。其中，21-三體綜合征、18-三體綜合征以及13-三體綜合征是最常見常染色體非整倍體疾病，是孕婦妊娠期間主要的篩查目標。在臨床上傳統(tǒng)方法仍然流行，早孕期和中孕期常規(guī)篩查項目包括胎兒頸項透明層厚度（nuchal translucency，NT）以及多項血清學(xué)指標，包括妊娠相關(guān)血漿蛋白-A（pregnancy-associated plasma protein-A，PAPP-A）、人絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，hCG）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游離雌三醇（u E3）、血清抑制素A（nhibin-A）等［14，15］。同時，結(jié)合孕婦情況和預(yù)產(chǎn)期有多種組合方案可選擇，包括二聯(lián)篩查（hCG、PAPP-A）、三聯(lián)篩查（AFP、uE3、hCG）、四聯(lián)篩查（AFP、u E3、h CG、nhibin-A）等。產(chǎn)前篩查旨在評估胎兒罹患染色體非整倍體疾病的風險，有利于減少不必要的侵入性操作［1］。目前，通過羊水穿刺進行核型分析仍是胎兒染色體非整倍體高風險人群進一步確診的“金標準”。傳統(tǒng)篩查方法的檢出率不高，侵入性檢測對孕婦和胎兒存在一定的風險，人們一直在尋求一種更可靠、更敏感、更安全的方法。表1總結(jié)了產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的常規(guī)篩查方法和確診手段。

表1 產(chǎn)前篩查和診斷胎兒染色體非整倍體的方法

孕婦外周血中cff-DNA的發(fā)現(xiàn)促進了無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的發(fā)展。無創(chuàng)產(chǎn)前檢查也稱非侵入性產(chǎn)前篩查，是通過采集孕婦外周血，提取血漿中的游離DNA（包含cff-DNA）進行檢測和分析。cff-DNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞，研究表明母體血漿的cff-DNA含量受多項母嬰特征影響，其占母體血漿總游離DNA的比例會隨著孕周增加而增加，隨孕婦的BMI指數(shù)增加而減小，但存在個體差異性［18-20］。在妊娠10～21周之間，cff-DNA約占母體血漿總游離DNA的10%～20%［21］。利用游離DNA進行檢測分析是困難的：低豐度的cff-DNA要求高靈敏度和特異性的檢測方法，同時直接獲取cff-DNA需要克服母體游離DNA的“干擾”［22，23］。

為此，研究者開發(fā)出特異性識別孕婦血漿中胎兒DNA／m RNA的方法：①表觀遺傳學(xué)染色體相對劑量法。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，利用胎兒DNA和母體DNA存在明顯的甲基化差異，Tong等［24］在位于胎兒18號染色體上的特異性低甲基化的SERPINB5基因位點進行標記，通過在該位點上的等位基因比率檢測到18-三體情況。②單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等位基因比率法。在母體血漿中胎兒胎盤特異性基因PLAC4存在單核苷酸多態(tài)性，對于雜合的整倍體胎兒，SNP的A／G等位基因應(yīng)在胎兒基因組中相等地表達1∶1的A／G，而在21-三體胎兒中，SNP等位基因之一的拷貝異常（A／GG），將產(chǎn)生2∶1或1∶2的比率關(guān)系。基于此，Lo等［25，26］通過位于PLAC4 mRNA上SNP位點的等位基因比例關(guān)系檢測21-三體胎兒，但該方法只適用于2個不同等位基因構(gòu)成的雜合子檢測；cff-DNA／m RNA的特異性標記能針對少數(shù)的SNP位點或DNA甲基化差異位點進行檢測，Y染色體特異性靶位點只能應(yīng)用于男性胎兒，且只能分析雜合SNP［27］。高通量測序和dPCR的使用促進了無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的發(fā)展。

2 高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體

高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體是基于母體血漿中的cff-DNA進行大規(guī)模平行基因組測序，并結(jié)合生物信息學(xué)工具，分析胎兒染色體數(shù)目異常時相應(yīng)的游離DNA數(shù)量的微小差異，進而評估胎兒的染色體非整倍體情況［6，28］。常用的高通量測序技術(shù)包括全基因組大規(guī)模平行測序和靶向測序。前者為全基因組的低深度測序，隨機地測序游離DNA片段，讀段序列被映射到人類全基因組參考序列圖譜上定位到染色體；后者選擇性地對染色體基因組上某特定區(qū)域擴增后測序，能夠增加通量并降低測序成本［29］。基于高通量測序的檢測平臺包括BGISEQ-100（1000）、Illumina HiSeq 2000、BioElectronSeq4000、MaterniT21 PLUS、NextSeq CN500等，通過結(jié)合生物信息學(xué)工具以評估胎兒染色體非整倍體情況。常見的評估標準是基于Z檢驗的方法。Z檢驗是利用大量的測序數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，進而比較某2個染色體的有效測序數(shù)據(jù)平均數(shù)的差異是否顯著［30］。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理計算得到Z值（Z-score）并擬設(shè)評估胎兒染色體非整倍體風險的參考閾值，以判斷非整倍體高風險或低風險，基于不同測序平臺的Z值可能不同。

2.1 高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的影響因素 高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體作為一項篩查測試，可能會出現(xiàn)假性結(jié)果（與染色體核型分析結(jié)果或與胎兒出生后隨訪結(jié)果不一致）。影響因素可能來自母體或胎兒的生物學(xué)因素，同時，高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的流程復(fù)雜，在標本處理、文庫制備、測序以及生物信息學(xué)分析等環(huán)節(jié)的多種因素均可能導(dǎo)致檢測失敗或檢測結(jié)果不準確［31，32］。

2.1.1 cff-DNA分數(shù)和生物學(xué)影響因素 孕婦血漿中cff-DNA含量是影響無創(chuàng)產(chǎn)前檢測準確性的關(guān)鍵因素。cff-DNA占母體血漿總游離DNA比例被稱為胎兒分數(shù)或胎兒比例，以百分比表示。高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測要求的最小胎兒分數(shù)因不同的方法而異，但隨著胎兒分數(shù)降低，檢出率下降［33］。目前建議用于高通量測序檢測的孕婦血漿中的胎兒分數(shù)大于4%［34］。研究表明，當孕婦外周血胎兒分數(shù)低于4%時，測序可能無結(jié)果或會出現(xiàn)假陰性結(jié)果［35］。胎兒分數(shù)受孕周、孕婦肥胖等影響，是一個重要的質(zhì)控指標［18，19］。在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中，富集cff-DNA有利于減少母體游離DNA的背景干擾，已有研究者開發(fā)了基于凝膠電泳的方法來富集cff-DNA，以提高胎兒非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的準確性［36］。

其他內(nèi)在的生物因素包括：①限制性胎盤嵌合體（confined placental mosaicism，CPM），是指胎盤與胎兒之間存在核型差異。由于母體血漿中的cff-DNA主要來自于胎盤滋養(yǎng)層細胞，當胎兒與胎盤染色體表現(xiàn)不一致，造成胎兒非整倍體檢出結(jié)果為假陽性或假陰性，即檢測結(jié)果未顯示胎兒的真實情況［37］。②雙胞胎的游離DNA含量無法估算，當出現(xiàn)雙胎之一存在染色體非整倍體的現(xiàn)象時，無法估算孕婦血漿中的cff-DNA含量或估算值比實際單胎的大，導(dǎo)致檢出結(jié)果與被“遮蓋”的胎兒情況不符［38］。③母體染色體嵌合現(xiàn)象即母體的非整倍體性低比例嵌合［39］，以及母體拷貝數(shù)失衡［40］。實際上，基于全基因組測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測能檢測21-三體、18-三體、13-三體綜合征外，其他染色體數(shù)目異常和部分染色體缺失重復(fù)的信息也可能檢測到，如性染色體非整倍體（sex chromosome aneuploidies，SCAs）、基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）等。但測序檢測是基于總的游離DNA進行，無法區(qū)分母體游離DNA與cff-DNA，當出現(xiàn)母體非整倍體低比例嵌合以及母體拷貝數(shù)失衡情況時，均可能引起胎兒染色體非整倍體檢測的假陽性結(jié)果，即與胎兒核型分析結(jié)果不一致。④其他可能，如母體惡性腫瘤等［41］。高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體可能會出現(xiàn)一定假陰性率和假陽性率，其陰性結(jié)果（低風險）不能總是保證胎兒正常，對于陽性結(jié)果（高風險）需要通過有創(chuàng)產(chǎn)前診斷進行驗證［8］。

2.1.2 測序以及數(shù)據(jù)分析影響因素 對孕婦血漿標本的分析前處理是成功進行游離DNA測序分析是關(guān)鍵的步驟，包括血液采集、血漿制備、血漿質(zhì)量控制（游離DNA的均勻性和純度）以及儲存和運輸?shù)龋?2-44］?；诟咄繙y序平臺的主要流程包括游離DNA提取、文庫構(gòu)建、上機測序以及生物信息學(xué)分析，每一個環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制均會影響后續(xù)操作以及測序結(jié)果的精確度，如DNA提取效率，測序DNA文庫濃度等［7，30］。為降低在不同的實驗平臺進行游離DNA提取定量、文庫的定量和質(zhì)量控制時出錯的風險，研究人員開發(fā)了可直接在檢測中定量cff-DNA分數(shù)的工具，包括Seq FF、SANEFALCON、BAYINDIR、DEFRAG等。其中，DEFRAG和BAYINDIR是基于Y染色體的方法，僅適用于懷有男胎的孕婦［45］。高通量測序的核心是把測序所得的序列比對到人類參考基因組，通過計數(shù)每個染色體的唯一對應(yīng)的序列數(shù)量來獲取全染色體拷貝數(shù)情況。因此，測序有效數(shù)據(jù)量、唯一比對序列數(shù)等也是控制數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要元素［30］。

GC含量是指樣本有效序列中鳥嘌呤（Guanine，G）和胞嘧啶（Cytosine，C）堿基對所占的比率。測序文庫構(gòu)建通常需要進行PCR擴增，PCR擴增過度會導(dǎo)致產(chǎn)生重復(fù)序列。同時，GC含量對PCR擴增也會產(chǎn)生影響，GC含量過高或者過低的基因組區(qū)域擴增較困難，導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差［46］。測序過程中，GC含量為40%～50%時測序讀取覆蓋度較高，GC含量過高或者過低時覆蓋度降低，這一性質(zhì)稱為GC偏倚［47］。GC偏倚是影響數(shù)據(jù)分析質(zhì)量的關(guān)鍵因素，在文庫制備（接頭連接，PCR擴增）以及測序過程均可能引入GC偏倚。Dineika等［32］描述了通過減少GC偏倚和更好地處理基因組重復(fù)序列來改善測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的方法。Strom等［48］證明通過GC偏倚校正和統(tǒng)計學(xué)處理可以提高高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的陽性預(yù)測值。

2.2 高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的質(zhì)量控制 孕婦血漿中cff-DNA低豐度性質(zhì)、影響cff-DNA含量變化因素的個體性和復(fù)雜性，以及在樣品制備、測序和分析過程中引入的技術(shù)誤差，這些不確定性使得對高通量測序的假陰性和假陽性結(jié)果的解釋具有挑戰(zhàn)性。通過建立和使用高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的參考物質(zhì)進行質(zhì)量控制，有助于校準測序數(shù)據(jù)和評估檢測性能［49］。理想的參考物質(zhì)應(yīng)可能地模擬孕婦血漿中游離DNA的組成和片段長度、分布等特征，為高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的標準化提供物質(zhì)基礎(chǔ)［50，51］?，F(xiàn)有參考物質(zhì)主要有2種形式：臨床樣本來源的母體血漿參考品以及人工制備的片段化基因組DNA參考品。

臨床樣本來源的天然母體血漿是理想的參考物質(zhì)，但來源有限。實現(xiàn)體外制備模擬人體血漿中游離DNA的參考物質(zhì)的方法主要有2種：超聲打斷和酶切消化。臨床檢驗中心采用超聲打斷21-三體、18-三體以及13-三體的人基因組DNA與正常非妊娠女性的血漿混合，制備了模擬游離DNA的參考物質(zhì)，用于高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測染色體非整倍體的室間質(zhì)量評價［52］。與完整的基因組DNA不同，在孕婦血漿中的游離DNA是短片段分子，其中cff-DNA主要來自于胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡末期的DNA片段，母體血漿中的游離DNA長度分布主峰為166bp，并具有以10bp遞減的分布規(guī)律［53］。超聲打斷的方法獲得片段化DNA與天然血漿中的游離DNA的長度（約100～200bp）、組成、分布等特征不完全一致；此外，一些測序檢測平臺進行生物信息學(xué)分析時是基于游離DNA片段大小分布來計算cff-DNA分數(shù)，超聲打斷的片段化DNA參考物質(zhì)不適用于此類原理測序平臺的評估［51，54］。2018年，美國病理學(xué)家學(xué)會使用臨床收集的懷有2l-三體、18-三體、13-三體胎兒的孕婦血漿樣本進行室間質(zhì)量評價，但由于來自于同一孕婦的血漿樣本有限，無法保證給參與實驗室提供相同的參考物質(zhì)，同時，他們也采用了人工制造的參考物質(zhì)進行室間質(zhì)量評價，實驗室測試結(jié)果顯示該參考物質(zhì)樣本的性能不如常規(guī)臨床樣本，且不適用于所有實驗室；他們表示臨床樣本來源的母體血漿是現(xiàn)有參考物質(zhì)的最好選擇［51］。

利用核酸酶消化細胞核所得DNA片段與真實的血漿樣本游離DNA特征更符合［50，55］。最近，Zhang等利用酶消化細胞核的方法制備了血漿游離DNA參考物質(zhì)：首先進行細胞系的培養(yǎng)，包括母親為正常染色體的細胞、胎兒為21-三體、18-三體、13-三體以及正常染色體的細胞，然后提取細胞核，利用酶消化得到產(chǎn)物，按梯度分數(shù)進行混合即完成片段化DNA混合物的制備，隨后為模擬真實孕婦血漿中的游離DNA環(huán)境，依據(jù)真實血漿組成成分制備了人工血漿，將兩者混合，建立了模擬血漿游離DNA的參考物質(zhì)［50］。其中，采用核酸酶（DFF和MNase）分別消化母系細胞核和胎兒細胞核以產(chǎn)生大小為160bp和140～150bp的DNA片段，以盡可能的模擬天然母體血漿中cff-DNA和母體游離DNA的大小分布特征。類似的，Jonatan等［55］使用具有親緣關(guān)系的女性及其21-三體后代的永生化細胞系（EBV病毒誘導(dǎo)永生化的人B淋巴細胞），通過提取DNA，酶消化處理（150～200bp），再與人工血漿混合，制備了無創(chuàng)產(chǎn)前檢測參考物質(zhì)。酶消化處理DNA片段化與人工血漿混合所得的模擬天然血漿與母體血漿環(huán)境仍有差別。目前還未完全清楚游離DNA如何產(chǎn)生，這與體內(nèi)復(fù)雜的酶作用有關(guān)聯(lián)，體外酶消化和生理環(huán)境中復(fù)雜酶作用也不一致［56］。

為高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體提供合適的參考物質(zhì)的主要挑戰(zhàn)和問題包括：使用孕婦血漿制備參考物質(zhì)受臨床來源所限；人工制備參考物質(zhì)需要考慮是否具有與真實游離DNA相似的特征，同時盡可能多的適應(yīng)不同的測序平臺；人工血漿與母體血漿基質(zhì)具有一定差異；酶消化細胞核的DNA片段產(chǎn)物需要考慮堿基序列組成的GC含量是否與孕婦血漿中游離DNA相似，以避免在測序過程中受GC偏倚的影響。

3 數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體

數(shù)字PCR是檢測和定量核酸的新技術(shù)［57］。其工作原理在于通過有限稀釋，使單個PCR反應(yīng)微室中包含或不包含單個模板DNA分子，結(jié)合特異性的熒光探針，進行平行擴增反應(yīng)，通過陽性反應(yīng)（顯示熒光信號）的數(shù)量和泊松分布統(tǒng)計即可測定原始樣本中DNA模板分子的數(shù)量。在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體應(yīng)用中，利用數(shù)字PCR具有單分子靈敏度和絕對定量的能力，通過直接定量目標染色體和參考染色體，計算兩者拷貝數(shù)比值即可判斷非整倍體情況［9，10］。整倍體胎兒和非整倍體胎兒的比值應(yīng)分別為1和高于1，這一程度取決于母體血漿中cff-DNA分數(shù)，例如當母體血漿中21-三體胎兒的游離DNA分數(shù)為10%時，理論比值約為1.05。數(shù)字PCR檢測非整倍體實驗原理和主要操作參考圖1。

圖1 數(shù)字PCR檢測染色體非整倍體實驗原理和主要操作說明圖，改編自參考文獻［11］

3.1 數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的優(yōu)勢 數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒非整倍體流程簡單，可直接獲取數(shù)據(jù)：提取游離DNA與數(shù)字PCR反應(yīng)試劑混合（包含用于目標染色體和參考染色體中的靶DNA分子的引物和探針），隨后進行PCR擴增，讀取發(fā)出熒光信號的單元數(shù)進一步確定靶DNA分子的拷貝數(shù)，通過泊松分布結(jié)合cff-DNA分數(shù)計算比值并判斷［11］。數(shù)字PCR基于“分而治之”，將單分子通過稀釋分離并獨自擴增，這樣先分離后放大的效果有利于降低本底信號（母體游離DNA）的影響，從而提高了對低豐度靶DNA分子（cff-DNA）的檢測靈敏度。高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體在臨床上的普遍篩查應(yīng)用存在一定限制：如測序成本較高，采樣和獲得結(jié)果之間需要1～2周的檢測周期等。與之相比，數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測具有流程簡單，對設(shè)備的要求相對較低，檢測耗時短，所需的設(shè)備和試劑的成本低的優(yōu)勢。目前的研究工作證明數(shù)字PCR能實現(xiàn)準確、快速、簡便的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體［11-13］。林文楚［58］等開發(fā)了基于數(shù)字PCR的檢測試劑盒，使用孕婦外周血，約5h完成對1個樣本無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，其成本約為高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的1／5。

3.2 數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的研究進展 在早期研究中，F(xiàn)an等［10］證明利用數(shù)字PCR定量檢測可以判斷21號染色體非整倍體異常：使用21-三體細胞系基因組DNA和人細胞系基因組DNA的混合物，結(jié)合特異性熒光探針標記21號染色體和12號染色體（參考染色體）進行擴增反應(yīng)，結(jié)果顯示兩者拷貝數(shù)比值大于1（正常為1。隨后的研究表示為在臨床上可靠的檢測母體血漿中低豐度的cff-DNA，需要進行數(shù)千至數(shù)萬PCR反應(yīng)［9，10，13］。隨著微控流技術(shù)的引入，數(shù)字PCR實現(xiàn)了高通量，自動化的快速發(fā)展，在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中表現(xiàn)出優(yōu)良的技術(shù)性能［59，60］。

基于微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，dd PCR），可以實現(xiàn)自動化反應(yīng)混合物的制備和液滴的產(chǎn)生，可以進一步提高測試的效率和通量。同時，在多重數(shù)字PCR中，通過設(shè)計不同引物，即可在一次PCR反應(yīng)同時對多個靶基因進行特異性擴增，提升檢測效率。El Khattabi等的［13］建立微滴式數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測21-三體，采用水解探針對4個靶基因標記，對213例孕婦血漿游離DNA進行定量檢測，結(jié)果顯示特異性為98%，敏感性為94%。Lee等［12］利用大小分級的方法來提高cff-DNA分數(shù)，并設(shè)計數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒21-三體，共測試877名孕婦血漿樣品，結(jié)果顯示其靈敏度為100%，特異性為99.64%，準確度為99.66%。隨著PCR反應(yīng)數(shù)增加，多重數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計也更加復(fù)雜?？紤]到大量特異性探針會產(chǎn)生高背景熒光，影響陽性反應(yīng)信號的檢測，Tan等［11］建立了基于鎖核酸通用型探針（locked nucleic acid-Taq Man，LNA-Taq Man）的多重微滴式數(shù)字PCR，用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體（21-三體），成功鑒定了30份臨床血漿標本的三倍體情況，檢測結(jié)果與高通量測序完全一致，每個樣本約4.5h完成測試。其中，鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）是一種核酸類似物，與DNA有很好的親和活性，將LNA參入到探針中可以提高對目的序列的親和力同時可以提高探針的Tm值，進而使探針設(shè)計的更短，有利于檢測短的DNA片段，提高檢測的靈敏度。表2總結(jié)了上述3個基于微滴式數(shù)字PCR進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體的實驗設(shè)計信息。

表2 基于數(shù)字PCR進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體

基于現(xiàn)有研究提示，可以得出以下經(jīng)驗：為提高數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的準確度和可靠性，在游離DNA的量確定的情況下，可以增加引物對的數(shù)量，以增加數(shù)字PCR檢測到的目標DNA分子的量；引物選擇應(yīng)避免引物對之間的相互作用［11］。對于較低cff-DNA分數(shù)的樣品，可以富集cff-DNA［12］。通過建立灰度區(qū)（在檢測中考慮為數(shù)據(jù)波動導(dǎo)致無法給出明確的高風險或者低風險結(jié)果建立的閾值范圍），灰區(qū)內(nèi)的樣本結(jié)果通過再測試來獲得準確的結(jié)果［11，13］。引物和探針的設(shè)計可以選擇目標染色體和參考染色體上的保守序列，在此基礎(chǔ)上篩選易于擴增、穩(wěn)定性好，GC含量適中的序列［58］。

4 總結(jié)與展望

2016 年，我國出行了孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷相關(guān)規(guī)定，臨床已經(jīng)開始使用基于高通量測序的無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體篩查檢測項目。隨著大規(guī)模平行測序技術(shù)的應(yīng)用逐步進入臨床，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的質(zhì)量控制和標準化也越來越重要?；赾ff-DNA的研究主要集中在各種檢測方法和測試的發(fā)展方面，對質(zhì)量控制和標準化的研究關(guān)注較少。制定參考標準有助于提高臨床診斷的準確性、可靠性以及標準化。數(shù)字PCR是檢測和定量核酸的新技術(shù)，近期的研究表明數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測胎兒染色體非整倍體可以實現(xiàn)高靈敏度的實時檢測且更具成本效益，隨進一步研究發(fā)展有望用于常規(guī)臨床檢測。