以VEGFR為靶點的齊墩果酸衍生物合成及其抗腫瘤活性研究

丁明雪，鄔月嬌，梅 宇，孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，主要以游離或組合糖苷的形式存在于各種植物中，包括青葉膽、孕牛漆、灌木膽等植物[1-2]，齊墩果酸衍生物具有多種藥理活性，包括保肝抗炎、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等[3-7].近年來，孟艷秋課題研究小組開展了齊墩果酸、積雪草酸、熊果酸等五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)修飾及體外抗腫瘤活性評價，并且通過計算機輔助藥物設(shè)計，在對化合物與蛋白靶點結(jié)合的模擬和分析方面取得了一定的進展[8-14].

靶向血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體VEGFR的藥物會降低血管內(nèi)皮生長因子的表達，消耗腫瘤細胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子，從而抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長.研究表明，OA可以抑制腫瘤細胞中VEGFR的表達，是其抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點[15].阿昔替尼(Axitinib)是由輝瑞公司開發(fā)的靶向VEGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑，用于晚期腎細胞癌癥患者[16-19].筆者利用計算機輔助藥物設(shè)計研究了阿昔替尼與VEGFR目標蛋白(PDB編號：5ew3)之間的相互作用，由結(jié)果可知阿昔替尼結(jié)構(gòu)中的胺基片段與VEGFR蛋白的氨基酸殘基TYR1136形成氫鍵，并與目標蛋白形成強大的結(jié)合力，且胺基是抗腫瘤作用的重要藥效團.筆者將孟艷秋研究小組提出的五環(huán)三萜化合物的結(jié)構(gòu)修飾與參與臨床研究的抗腫瘤化合物相結(jié)合，在齊墩果酸A環(huán)形成含氮雜環(huán)并將芳香胺活性基團引入到C-28 位，設(shè)計合成了5個衍生物 Ⅰ1～Ⅰ5.使用Glide軟件對設(shè)計的化合物進行基于分子對接的虛擬篩選，結(jié)果顯示VEGFR蛋白與化合物Ⅰ5的結(jié)合方式顯示出較強的結(jié)合能力.

1 實驗部分

1.1 目標化合物的合成路線

化合物的合成路線見圖1.

a 丙酮，瓊斯試劑，室溫 b 草酰氯，芳香胺，吡啶，1，2-二氯乙烷，室溫，4 h c 甲酸乙酯，叔丁醇鉀，二氯甲烷，室溫，10 h d 水合肼，無水乙醇，83 ℃回流4 h圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of the target compounds

1.2 目標化合物的合成

1.2.1 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1) 的制備

取0.500 g OA(1.10 mmol)置于100 mL茄形瓶中，用50 mL丙酮將其充分溶解，在冰浴條件下滴加0.65 mL(5.78 mmol)瓊斯試劑，25 min后轉(zhuǎn)室溫反應(yīng)約2.5 h.滴加20 mL異丙醇淬滅45 min，減壓蒸除溶劑，用飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水NaSO4干燥.粗制產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱色譜純化得0.474 g白色固體OA-1，產(chǎn)率95.6%，mp 221.6～222.9 ℃.

1.2.2 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-2) 的制備

取OA-1(0.500 g，1.10 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入25 mL干燥的1，2-二氯乙烷溶解，冰浴條件下滴加草酰氯(0.47 mL，1.20 mmol)，40 ℃加熱并且回流，反應(yīng)約4 h，減壓蒸除溶劑，殘余物用10 mL環(huán)已烷洗滌3次.取苯胺溶解到30 mL二氯甲烷中，滴加制備的酰氯，放入0.10 g 4-二甲氨基吡啶和0.5 mL吡啶，室溫下反應(yīng)12 h.加入15 mL飽和食鹽水，用2 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為3～4，分離有機層，飽和食鹽水和二氯甲烷萃取3次，合并有機相，無水NaSO4干燥.粗制品經(jīng)硅膠柱色譜純化得0.359 g淡黃色晶體OA-2，產(chǎn)率67.3%，mp 123.6～126.7 ℃.

1.2.3 2-羥亞甲基-3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-3)的制備

取OA-2(0.400 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入15 mL無水甲苯溶解，冰浴條件下加入0.20 g叔丁醇鉀，滴加1 mL甲酸乙酯，20 min后升為室溫反應(yīng)12 h.減壓蒸除溶劑，得淡黃色油狀固體，經(jīng)稀鹽酸洗滌，用飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水NaSO4干燥.粗品用硅膠柱色譜純化得0.315 g淡黃色片狀固體OA-3，產(chǎn)率78.8%，mp 196.2～197.5 ℃.

1.2.4 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-苯胺(Ⅰ1)的制備

取OA-3(0.300 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，溶于20 mL無水乙醇，滴加0.2 mL水合肼，83 ℃冷凝回流4 h.減壓蒸除溶劑無水乙醇，再用乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，合并有機相得到黃色澄明液體，減壓蒸除溶劑乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.173 g淡黃色固體Ⅰ1，產(chǎn)率57.7%，mp 183.5～184.7 ℃.

1.2.5 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-對甲氧基苯胺(Ⅰ2)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與對甲氧基苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.186 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ2，產(chǎn)率62.0%，mp 189.5～190.7 ℃.

1.2.6 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-間氟苯胺(Ⅰ3)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與間氟苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.166 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ3，產(chǎn)率55.3%，mp 191.5～192.7 ℃.

1.2.7 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-對硝基苯胺(Ⅰ4)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與對硝基苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.156 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ4，產(chǎn)率52.0%，mp 187.6～188.9 ℃.

1.2.8 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-間氯苯胺(Ⅰ5)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與間氯苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.193 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ5，產(chǎn)率64.3%，mp 192.1～193.7 ℃.

2 分子對接

使用Glide軟件(Maestro版11.5.011，MMshare版4.1.011、2018-1版)對設(shè)計的化合物進行基于分子對接的虛擬篩選.用VEGFR作為靶點(PDB編號：5ew3)，從http://www.rcsb.org/pdb下載.Protein Preparation Wizard模塊用于蛋白結(jié)構(gòu)的準備，例如添加氫，填充缺失的側(cè)鏈和去除結(jié)合口袋中水分子等.Receptor Gride Generation模塊用于生成受體格點文件.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的共結(jié)晶配體確定結(jié)合位點的位置，以超高精度(XP)模式進行分子對接篩選，化合物Ⅰ1～Ⅰ5對接結(jié)果打分見表1.能量分數(shù)的絕對值越大，結(jié)合能力越強.由表1可以看出：化合物Ⅰ5與靶蛋白自身配體能量分數(shù)幾乎一致，表現(xiàn)出與VEGFR有較強的結(jié)合能力，值得進一步研究.通過對比阿昔替尼和化合物Ⅰ5與靶蛋白的對接圖(圖2、圖3) 發(fā)現(xiàn)阿昔替尼和化合物Ⅰ5與靶蛋白連有相同的疏水氨基酸殘基(關(guān)鍵氨基酸：TYR1136、ARG1126、LEU1140、ARG1124)，且胺基片段均與TYR1136產(chǎn)生氫鍵作用，初步判斷化合物Ⅰ5和阿昔替尼與靶蛋白具有相同的結(jié)合位點.

表1 不同化合物與VEGFR的能量得分比較Table 1 Comparison of energy scores between different compounds and VEGFR

圖2 阿昔替尼與VEGFR活性位點的結(jié)合Fig.2 Binding of Axitinib to the active site of VEGFR

圖3 化合物Ⅰ5與VEGFR活性位點的結(jié)合Fig.3 Binding of compound Ⅰ5 to the active site of VEGFR

3 結(jié)果與討論

3.1 目標化合物的表征

設(shè)計合成的5個新型齊墩果酸衍生物的結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、NMR確證，結(jié)果見表2、表3和表4.

表2 MS目標化合物數(shù)據(jù)Table 2 MS target compound data

表3 1H-NMR目標化合物數(shù)據(jù)Table 3 1H-NMR target compound data

表4 13C-NMR目標化合物數(shù)據(jù)Table 4 13C-NMR target compound data

3.2 初步體外活性測試

采用MTT比色法測試合成的化合物初步體外抗腫瘤活性.以吉非替尼和阿霉素為陽性對照，實驗方法參見文獻[20]，實驗結(jié)果見表5.由表5可知:目標化合物對HepG2 和 MCF-7 細胞的生長均具有一定的抑制作用，目標化合物IC50值Ⅰ5>Ⅰ4>Ⅰ2>Ⅰ1>Ⅰ3.因此，OA在C-28位酰胺化結(jié)構(gòu)修飾時化合物會有更好的活性，其化合物Ⅰ5值得進一步研究.

表5 目標化合物對HEPG2和MCF-7細胞增殖的抑制活性Table 5 Inhibitory activity of the target compounds on the HepG2 and MCF-7 cells proliferation

3.3 VEGFR受體抑制實驗

采用熒光偏振免疫分析法，對通過計算機輔助設(shè)計模擬結(jié)合力較好且體外生物活性較好的化合物Ⅰ5進行VEGFR受體抑制活性測試，通過GraphPad Prism 5計算得Ⅰ5在10 mg/L時的IC50值為3.57 μmol/L，結(jié)果表明化合物Ⅰ5對VEGFR蛋白具有較好的抑制作用.

4 結(jié) 論

筆者以O(shè)A為起始原料，使用計算機輔助藥物設(shè)計對接模擬，將含氮雜環(huán)引入A環(huán)并在C-28位形成酰胺，合成了5種新的齊墩果酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通過MS和NMR確證，且在人肝癌細胞(HepG2)和乳腺癌細胞(MCF-7)中均具有良好的生長抑制活性，其中化合物Ⅰ5對HepG2細胞的抑制率優(yōu)于陽性對照物吉非替尼，說明齊墩果酸A環(huán)引入吡唑環(huán)具有更好的抗腫瘤活性.VEGFR受體蛋白抑制實驗表明化合物Ⅰ5對VEGFR受體表現(xiàn)出較強的抑制活性.該研究結(jié)果對進一步優(yōu)化設(shè)計齊墩果酸衍生物作為VEGFR受體抑制劑的研究具有一定的指導意義，為研發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定良好的理論基礎(chǔ).