巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)介導(dǎo)的生物傳感研究進(jìn)展

鄭淑娟 仝濤，2 許文濤，2，3 黃昆侖，2，3

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是通過(guò)碳-雜原子鍵的連接快速合成有用的新化合物的反應(yīng)，由化學(xué)家Sharpless、Kolb及Finn于2001年提出后受到越來(lái)越多的關(guān)注［1］。點(diǎn)擊化學(xué)有以下一種或多種特征：反應(yīng)快速；通量合成高；操作簡(jiǎn)單；反應(yīng)條件溫和；原料來(lái)源廣；反應(yīng)產(chǎn)物易純化，產(chǎn)物得率高［1］。

點(diǎn)擊反應(yīng)的有多種，包括環(huán)加成反應(yīng)、親核開(kāi)環(huán)反應(yīng)、非醇醛的羰基化反應(yīng)、碳-碳多重鍵加成反應(yīng)、疊氮-膦偶合反應(yīng)。狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（Diels-Alder reaction）和 1，3-偶極-環(huán)加成反應(yīng)（copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）屬于環(huán)加成反應(yīng)；氮丙啶、環(huán)氧化物和環(huán)狀硫酸酯等發(fā)生的反應(yīng)屬于親核開(kāi)環(huán)反應(yīng)；腙、肟醚和芳香族雜環(huán)的形成屬于非醇醛的羰基化反應(yīng)；二羥基化反應(yīng)和環(huán)氧化反應(yīng)屬于碳-碳多重鍵加成反應(yīng)；施陶丁格連接屬于疊氮-膦的偶合反應(yīng)。

按照是否需要金屬作為反應(yīng)催化劑可以將點(diǎn)擊反應(yīng)分為金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)和無(wú)金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)。如CuAAC為金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，而疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted alkyne-azide cycloadditions，SPAAC）和巰基-烯（thiol-ene）點(diǎn)擊反應(yīng)則為無(wú)金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)。金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)在生物學(xué)領(lǐng)域的使用具有一定的限制性，因金屬離子難以被純化分離，而且具有潛在的生物毒性作用，可能會(huì)損害機(jī)體健康。因此，無(wú)金屬催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)如狄爾斯-阿爾德反應(yīng)、施陶丁格連接和巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)受到了廣泛的關(guān)注。

在材料合成和生物分子標(biāo)記中，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)都發(fā)揮著重要的作用。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)被廣泛的應(yīng)用于生物大分子的合成如樹(shù)枝狀化合物的合成和聚合物的合成等方面。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸鏈和聚糖等生物分子的標(biāo)記中。另外，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在材料表面功能化方面也具有很重要的作用。在生物傳感方面，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對(duì)巰基烯點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行了綜述，詳細(xì)介紹了巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理、影響反應(yīng)速率的因素和生物大分子的標(biāo)記。并且介紹了巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)介導(dǎo)的生物傳感器及與生物傳感相關(guān)的應(yīng)用，包括生物功能化納米材料和細(xì)胞成像等方面。最后對(duì)巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在生物傳感領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)偶聯(lián)機(jī)理及性質(zhì)

硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)通常包括自由基介導(dǎo)的巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)和親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應(yīng)（圖1）。自由基引發(fā)的巰基-烯反應(yīng)機(jī)理可以分為以下幾個(gè)步驟：首先，在加熱或光照的條件下，引發(fā)劑吸收能量被激發(fā)裂解，形成自由基；接著，形成的自由基和巰基發(fā)生反應(yīng)，奪取巰基上的氫原子，觸發(fā)巰基自由基形成；然后，形成的巰基自由基和烯基發(fā)生反應(yīng)，形成烷基自由基；最后，烷基自由基會(huì)進(jìn)攻巰基化合物，奪取巰基上的氫原子，引發(fā)鏈增長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生新的巰基自由基。這些新產(chǎn)生的巰基自由基可繼續(xù)和烯基反應(yīng)。其中第二步產(chǎn)生的巰基自由基可引發(fā)鏈增長(zhǎng)也可以發(fā)生雙基終止［2］。親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理包括以下步驟：硫醇與親核試劑的反應(yīng)促使巰基去質(zhì)子化，成為相應(yīng)的硫酸鹽陰離子。硫酸鹽是一種很強(qiáng)的親核體，與活化的C=C加成，形成中心碳為陰離子的中間體。之后這個(gè)中間體吸收一個(gè)質(zhì)子，形成巰基-烯產(chǎn)物［3］。

圖1 常見(jiàn)的巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)類型［4］Fig. 1 Common types of thiol-ene click chemistry reactions

近幾年，巰基-烯反應(yīng)點(diǎn)擊化學(xué)的特性受到了人們的廣泛關(guān)注，在生物應(yīng)用領(lǐng)域也已經(jīng)擴(kuò)展到交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、生物傳感以及功能化生物材料等方面。從合成的角度看，巰基-烯的反應(yīng)有十分顯著的優(yōu)勢(shì)，如反應(yīng)速度快，應(yīng)用范圍廣（不管反應(yīng)物活性如何，大多數(shù)的烯烴和所有的巰基幾乎都能滿足反應(yīng)條件），基本上屬于最簡(jiǎn)便的一種無(wú)金屬催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。

2 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的影響因素

2.1 巰基結(jié)構(gòu)對(duì)反應(yīng)速率的影響

參與巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的巰基化合物主要有4種，包括烷基硫醇酯類、烷基（芳基）硫醇類、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。在巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)速率和巰基化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。含有推電子基團(tuán)的巰基化合物的反應(yīng)活性較高，如異丙撐基；含有吸電子基團(tuán)的巰基化合物反應(yīng)活性較低，如酯基。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的巰基化合物的反應(yīng)活性由小到大分別為硫苯酚類、烷基硫醇酯、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。

2.2 烯類單體結(jié)構(gòu)對(duì)反應(yīng)速率的影響

缺電子烯和富電子烯與巰基的反應(yīng)是巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的主要兩種類型。巰基與富電子烯之間反應(yīng)迅速，如降冰片烯與巰基的反應(yīng)速率很快。巰基與缺電子烯之間反應(yīng)較慢，如馬來(lái)酰亞胺、丙烯酸酯等。這是由于缺電子烯的雙鍵需要被激活，所以需要弱堿性的催化劑催化才能進(jìn)行，如三乙胺等親核試劑。一般而言，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的反應(yīng)速率隨著烯類單體碳碳雙鍵電荷密度的下降而下降。

為了確定不同烯烴在巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)中的速率，Cramer等［5］將硫醇和丙烯酸酯、丙烯基醚、乙烯基醚、降冰片烯和乙烯基氮烷分別與tetrathiola進(jìn)行光聚合反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，降冰片烯的聚合速率最大，為6.0；其次是乙烯基醚，為4.8。在這兩種反應(yīng)中烯基官能團(tuán)和巰基官能團(tuán)對(duì)反應(yīng)速率的貢獻(xiàn)率相等。烯類單體反應(yīng)速率的由小到大的順序?yàn)椋合┍?、丙烯酸酯類、乙烯基硅氮烷、乙烯基醚和降冰片烯?/p>

表1 不同烯烴與tetrathiola在巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)中的最大速率Table 1 Maximum rates of different olefins in thiol-ene click reactions with tetrathiola

2.3 巰基和雙鍵官能團(tuán)的濃度

在巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的光聚合體系中，反應(yīng)速率與巰基和烯基官能團(tuán)的濃度呈一級(jí)反應(yīng)。光聚合反應(yīng)速率與鏈增長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Kp）和鏈轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Kct）比值顯著相關(guān)。在反應(yīng)起始階段，反應(yīng)體系中存在著足量的巰基和烯基，二者的消耗速率相等。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，會(huì)出現(xiàn)3種不同的情況：當(dāng)Kp≈Kct時(shí)，聚合反應(yīng)的速率與巰基官能團(tuán)和雙鍵官能團(tuán)的濃度都相關(guān)；當(dāng)Kp＜＜Kct時(shí)，聚合反應(yīng)的速率僅和雙鍵的濃度呈一級(jí)反應(yīng)；當(dāng)Kp＞＞Kct時(shí)，聚合反應(yīng)的速率僅和巰基的濃度呈一級(jí)反應(yīng)［4］。

3 巰基-烯反應(yīng)介導(dǎo)的生物標(biāo)記技術(shù)

目前，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)應(yīng)用于反應(yīng)物官能化和聚合反應(yīng)中，并且在生物分子的官能化方面已經(jīng)有良好的應(yīng)用。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)滿足生物材料所要求的選擇性、易于實(shí)施和高產(chǎn)率的特點(diǎn)，因此可以應(yīng)用于生物材料的標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)生物分子功能化。雖然熱敏自由基引發(fā)劑如偶氮二異丁腈已經(jīng)被應(yīng)用于在生物材料的功能化領(lǐng)域，但是在大規(guī)模合成時(shí)，受反應(yīng)器設(shè)計(jì)和光衰減等因素的限制，升高反應(yīng)溫度才能更好的實(shí)現(xiàn)生物材料本體自由基均勻生成［6］。而巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在不需要升高溫度的條件下，也可以容易地實(shí)現(xiàn)生物材料本體自由基均勻化和官能化。

3.1 巰基-烯反應(yīng)在DNA分子標(biāo)記中的應(yīng)用

利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將官能化的DNA分子應(yīng)用于DNA微流控芯片領(lǐng)域，以實(shí)現(xiàn)鑒定單堿基對(duì)錯(cuò)配等目的。利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將巰基修飾的DNA分子以共價(jià)鍵的方式固定到烯基修飾的硅基材料上，得到固定密度約6 pmol/cm2的DNA微陣列。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要使用交聯(lián)劑，并且具有直接連接、照射時(shí)間短（20 min）和雜交效率高（65%）的優(yōu)點(diǎn)。得到的DNA微陣列可以對(duì)單堿基對(duì)錯(cuò)配進(jìn)行鑒定［7］。另外，利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)還可以將生物素探針固定于巰基化的硅表面。之后借助于鏈霉親和素就可以實(shí)現(xiàn)生物素化DNA與硅基表面的組裝，形成DNA微流控芯片。該方法獲得的微流控芯片具有2 pmol/cm2的固定化密度和90%以上的雜交效率，性質(zhì)優(yōu)良［8］。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)還可以應(yīng)用于制備特異性性檢測(cè)沙門(mén)氏菌PCR產(chǎn)物的核酸微陣列。這種核酸微陣列由多巰基化的DNA與硅基材料通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制得，靈敏度達(dá)到20 μmol/L。并且這種硅基材料探針連接方式能夠改善以核酸微陣列為基礎(chǔ)的分析技術(shù)在重復(fù)性、可靠性和分析靈敏度方面的不足［9］。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將巰基封端的鄰苯二甲酸酯的核酸適配體結(jié)合到載體上，得到一種新型的基于適配體的鄰苯二甲酸酯吸附劑。這種方法為特異性富集和高靈敏度檢測(cè)鄰苯二甲酸酯提供了新的方法，吸附回收率高達(dá)66.10%-108.90%［10］。除了硅基材料，利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)還能將官能化的DNA引入金表面。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將聚丁二烯的低聚物固定在α，ω-二硫醇巰基化的金表面上。之后再次通過(guò)巰基-點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)使聚丁二烯殘基與含巰基的化合物偶聯(lián)，包括十八烷硫醇，1H、1H、2H、2H-全氟烷硫醇和巰基封端的25聚體 DNA［11］。另外，Wang等［12］利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將巰基化的凝血酶適配體固定在有機(jī)二氧化硅平臺(tái)上，得到一種新型的核酸適體基有機(jī)硅雜化整體柱。這種親和柱可以用來(lái)富集凝血酶，檢測(cè)限為0.01 μmol/L，具有簡(jiǎn)單、快速和高效的特點(diǎn)。

3.2 巰基-烯反應(yīng)在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)在巰基或烯基的官能化后可以用來(lái)進(jìn)行巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。對(duì)生物素或生物素蛋白進(jìn)行烯丙基官能化之后，利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到巰基化的表面上。蛋白質(zhì)的偶聯(lián)密度受暴露時(shí)間控制。并且蛋白質(zhì)在與表面偶聯(lián)后仍能保持活性［13］。Witrotk等［14］利用免疫相容的硫醚與牛血清白蛋白結(jié)合來(lái)制備與腫瘤相關(guān)的疫苗。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將烯丙基官能化的牛血清白蛋白核心與巰基糖肽偶聯(lián)，得到一種新的生物大分子。每個(gè)分子平均可以達(dá)到8個(gè)糖肽。

3.3 巰基-烯反應(yīng)在其他化合物標(biāo)記中的應(yīng)用

化合物被巰基或烯基標(biāo)記之后，不僅可以用來(lái)制備水凝膠、利用糖-蛋白質(zhì)特異識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別蛋白質(zhì)，還可以被應(yīng)用于生物醫(yī)藥中，如制備藥物、遞送藥物等。

利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以使巰基乙醇與核心為碳水化合物單體的樹(shù)枝狀大分子末端烯基發(fā)生連續(xù)的合成反應(yīng)，得到的合成產(chǎn)物可以應(yīng)用于細(xì)菌黏附［15］。這個(gè)反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)效率高達(dá)94%。Ortiz等［16］開(kāi)發(fā)出一種利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)快速制備水凝膠的新方法。在該方法中，利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以在20 s 內(nèi)完成硫醇單體與二烯醚基官能團(tuán)化的水凝膠分子聚合，得到聚合網(wǎng)絡(luò)。硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和氮雜-邁克爾加成反應(yīng)可以用于制備磺基甜菜堿官能化的聚縮醛樹(shù)狀大分子。這種生物大分子表現(xiàn)出pH響應(yīng)藥物釋放行為，并且在負(fù)載了阿霉素后顯示出顯著的抗癌活性。這種制備方法不僅為聚縮醛樹(shù)狀聚合物的應(yīng)用提供了新的思路，而且為開(kāi)發(fā)具有臨床應(yīng)用潛力的抗癌納米材料提供了參考［17］。碳水化合物被巰基或烯基標(biāo)記之后，還可以用于識(shí)別特定蛋白。由于糖和蛋白質(zhì)具有互補(bǔ)識(shí)別系統(tǒng)，利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將標(biāo)記了巰基的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）與涂覆在石英表面的烯烴偶聯(lián)，制備得到碳水化合物傳感器。這種傳感器可用于凝集素的檢測(cè)，具有快速、有效和通量高的特點(diǎn)，并且可以檢測(cè)未標(biāo)記的蛋白質(zhì)［18］。

利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以構(gòu)建具有藥物遞送功能的膠束結(jié)構(gòu)。Chen等［19］利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)將乙烯基的官能化的聚乙二醇-甲基丙烯酸酯與葡萄糖胺偶聯(lián)，得到的產(chǎn)物為葡萄糖官能化的聚甲基丙烯酸2-羥乙酯。這種產(chǎn)物可以形成熱可逆膠束，能夠用于包封藥物。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以用于高效生產(chǎn)具有抑制糖苷酶和抗H病毒活性的硫代二糖。通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將含巰基的糖分子和含烯基的糖分子進(jìn)行偶聯(lián)，得到硫代二糖。這種方法具有產(chǎn)率高、便捷，在硫代二糖的生產(chǎn)方面具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)［20］。

利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將含有喜樹(shù)堿的甲硅烷基醚固定在介孔二氧化硅納米顆粒上，得到喜樹(shù)堿介孔二氧化硅納米顆粒。在正常血漿條件下（pH7.4），喜樹(shù)堿介孔二氧化硅納米顆粒不會(huì)釋放喜樹(shù)堿；在體外酸性條件下（pH4.0），喜樹(shù)堿會(huì)從介孔二氧化硅納米顆粒中釋放。這種功能化的納米粒子具有藥物控制釋放的臨床治療潛力［21］。利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將C6位上烯基化的殼聚糖和巰基化的聚乙二醇交聯(lián)，得到pH響應(yīng)型殼聚糖水凝膠。這種水凝膠的溶脹和收縮可以有效調(diào)節(jié)阿霉素和牛血清白蛋白在不同pH介質(zhì)中的相應(yīng)釋放行為。通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)得到的殼聚糖水凝膠可能為藥物靶向遞送提供一種新的載體［22］。

4 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在生物傳感中的應(yīng)用

隨著巰基-烯反應(yīng)應(yīng)用范圍的不斷拓寬以及生物傳感器在檢測(cè)中的快速發(fā)展，巰基-烯反應(yīng)介導(dǎo)的生物傳感器逐漸增多，如熒光生物傳感器、細(xì)胞傳感器、電化學(xué)傳感器等。可以實(shí)現(xiàn)miRNA、DNA、含有巰基的生物活性物質(zhì)、整合素αvβ3過(guò)表達(dá)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、葡萄糖氧化酶、乳糖酶和凝集素等的檢測(cè)。

4.1 熒光生物傳感器

在熒光生物傳感方面，巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)發(fā)揮了重要的作用。Su等［23］通過(guò)在硅納米顆粒表面結(jié)合DNA分子，構(gòu)建了能夠檢測(cè)癌癥相關(guān)基因miR-21的DNA共軛硅納米粒子（SiNPs）。巰基官能化DNA通過(guò)與烯烴接枝的SiNP發(fā)生巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，生成SiNP-DNA綴合物。當(dāng)沒(méi)有靶標(biāo)miR-21時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離很近，整個(gè)反應(yīng)體系處于熒光淬滅的狀態(tài)，不顯現(xiàn)熒光；當(dāng)靶標(biāo)miR-21出現(xiàn)時(shí)，miR-21可以與DNA的一條鏈發(fā)生鏈置換反應(yīng)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，顯現(xiàn)熒光。因此可以通過(guò)是否顯示熒光來(lái)判斷癌癥相關(guān)基因miR-21是否存在。這種方法不僅反應(yīng)條件溫和，而且具有良好的特異性，可以應(yīng)用于癌癥的治療和診斷。有學(xué)者報(bào)道了一種通過(guò)在硅表面上使用固定化分子信標(biāo)來(lái)檢測(cè)DNA的方法。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將熒光標(biāo)記的探針連接到硅基表面。錨定的分子信標(biāo)能夠以微陣列形式高選擇性和靈敏度的與互補(bǔ)靶標(biāo)雜交，檢測(cè)限為（9.9 ± 1.1）nmol/L［24］。利用巰基-稀點(diǎn)擊反應(yīng)制作的合成紙產(chǎn)生的熒光信號(hào)能夠用于檢測(cè)全脂牛奶中的抗生素恩諾沙星。合成紙的檢測(cè)限為1.64 nmol/L，低于玻璃和硝化纖維素基質(zhì)［25］。Rong等［26］設(shè)計(jì)了一種基于谷胱甘肽調(diào)制的開(kāi)啟熒光策略的開(kāi)啟式上轉(zhuǎn)換熒光傳感器，用于快速檢測(cè)丙烯酰胺。首先通過(guò)水熱法制備了聚乙烯亞胺改性的上轉(zhuǎn)換納米顆粒，然后通過(guò)非共價(jià)鍵合將羅丹明B衍生物負(fù)載在其表面上。谷胱甘肽與羅丹明B衍生物耦合后，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移強(qiáng)烈淬滅上轉(zhuǎn)換熒光。加入三（2-羧乙基）膦后，有效催化了谷胱甘肽和丙烯酰胺之間的巰基-烯邁克爾加成反應(yīng)，觸發(fā)被淬滅的熒光。利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和葉酸改性制備的C60熒光納米顆?？梢造`敏且特異性的檢測(cè)葉酸。并且這種C60熒光納米顆粒易于進(jìn)入葉酸受體表達(dá)水平更高的癌細(xì)胞，從而識(shí)別靶標(biāo)細(xì)胞并對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞成像［27］。利用馬來(lái)酰亞胺將四苯基乙烯官能化后，可以得到馬來(lái)酰亞胺-四苯基乙烯復(fù)合物。當(dāng)含有巰基的生物活性物質(zhì)存在時(shí)，馬來(lái)酰亞胺-四苯基乙烯復(fù)合物中的馬來(lái)酰亞胺側(cè)鏈會(huì)和巰基發(fā)生巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。得到的產(chǎn)物具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射性質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生熒光。這種方法的檢測(cè)限低至1 ppb，并且產(chǎn)生的信號(hào)易于觀察。另外，所制備的馬來(lái)酰亞胺-四苯基乙烯復(fù)合物還可作為可視化試劑對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色。這種方法制備的細(xì)胞熒光圖像可用來(lái)描繪細(xì)胞中巰基物質(zhì)分布［28］。

4.2 細(xì)胞傳感器

巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)還被應(yīng)用于細(xì)胞傳感器。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以用于檢測(cè)特異蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞。利用CuAAC和巰基-烯雙點(diǎn)擊的方法可以制備的N-乙?；?1-半胱氨酸-聚甲基丙烯酸甲酯-b-聚己內(nèi)酯嵌段共聚物（N-Acetyl-l-cysteine-capped poly（methyl methacrylate）-b-polycaprolactone block copolymer，PMMA-b-PCL-NAC）可以作為生物分子結(jié)合的固定基質(zhì)。通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式可以將精氨酸甘氨酸天冬氨酸（arginine（R），glycine（G），and aspartic acid（D），RGD）肽序列固定到PMMA-b-PCL-NAC的表面上，形成PMMA-b-PCL-NAC-RGD平臺(tái)。之后可通過(guò)光學(xué)特異性和電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)監(jiān)測(cè)整合素αvβ3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞［29］。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將巰基化透明質(zhì)酸/巰基化明膠的巰基基團(tuán)與聚乙二醇-降冰片烯分子的烯基快速偶聯(lián)，得到透明質(zhì)酸/明膠水凝膠。利用分子印刷儀器能夠直接印刷和控制水凝膠基質(zhì)內(nèi)活細(xì)胞的固化，實(shí)現(xiàn)微米級(jí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞印刷，制備微米級(jí)細(xì)胞圖案［30］。

4.3 電化學(xué)傳感器

巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在電化學(xué)傳感器中也具有很好的應(yīng)用前景。例如，利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將石墨烯（graphene，GR）與半胱胺鹽酸鹽（HS-（CH2）2-NH2·HCl）結(jié)合，得到功能化的石墨烯表面。石墨烯表面的N原子能吸附并穩(wěn)定金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNP）， 形 成 GR-Cys-AuNPs復(fù)合物。將獲得的GR-Cys-AuNPs復(fù)合物沉積在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上，通過(guò)電化學(xué)的方法可以確定確定樣品中尿酸（uric acid，UA）和葉酸（folic acid，F(xiàn)A）的含量（圖2）［31］。Zeng等［32］利用巰基-烯基點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將含有烯基的Ru（bpy′）3Cl2衍生物和含有巰基的3-巰丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行偶聯(lián)，將Ru（bpy′）3Cl2衍生物固定在3-巰丙基三甲氧基硅烷預(yù)處理的氧化銦錫基底上，制備了固態(tài)電化學(xué)發(fā)光傳感器。使用三正丙胺作為模型分析物時(shí)，這種電化學(xué)傳感器的線性范圍在（5×10-6-5×10-3）mol/L之間，檢測(cè)限為1×10-6mol/L。這種固定化方法簡(jiǎn)單、快速、高效。并且所得到的 Ru（bpy′）32+單層膜在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性。

圖2 GR-Cys-AuNPs納米復(fù)合傳感器的制備示意圖［31］Fig. 2 Schematic diagram of the fabrication of GR-Cys-AuNPs nanocomposite sensor［31］

4.4 其他類型傳感器

利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將聚乙烯亞胺修飾在負(fù)載表面上，得到的多胺表面具有高的表面氨基濃度和鏈霉抗生物素蛋白負(fù)載能力。這種方法在氨基酸和蛋白質(zhì)傳感方面有很大的優(yōu)勢(shì)［33］。利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將聚乙二醇、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽和精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸肽引入到烯烴修飾的底物上。這種方法可以很好地用在內(nèi)皮細(xì)胞的高通量篩選中［34］。通過(guò)使用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，還可以在負(fù)載表面上快速、簡(jiǎn)便、易行的固定酶。具體方法在玻璃表面上生成烯烴封端的自組裝單層膜，之后通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，使得酶的游離巰基和基質(zhì)上的烯烴之間形成共價(jià)鍵，從而可以實(shí)現(xiàn)酶的固定。利用這種方法固定的酶不會(huì)失去原有的活性，如葡萄糖氧化酶和乳糖酶被固定之后仍然具有活性。這種方法在表面上綴合酶?jìng)鞲衅麝嚵蟹矫婢哂泻艽蟮膽?yīng)用潛力［35］。

巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在碳水化合物傳感器中也有應(yīng)用。在石英表面先進(jìn)行烯烴/炔烴的涂覆，隨后利用巰基-烯和巰基-炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)使得含有烯烴/炔烴的表面與能夠和凝集素特異性結(jié)合的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）直接在一滴水中進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的特異性檢測(cè)。這種方法具有高速、有效、通量高的特點(diǎn)，且對(duì)未標(biāo)記的蛋白質(zhì)也可以進(jìn)行檢測(cè)［18］。

5 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

生物成像可以用于詳細(xì)了解細(xì)胞過(guò)程和疾病機(jī)制。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)作為無(wú)金屬參與的點(diǎn)擊反應(yīng)，在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)物毒性以及生物利用度等屬性上都十分適用于生物分子在細(xì)胞及體內(nèi)的成像，有助于人們更好地了解生物分子參與的生物過(guò)程以及在生物體系中的發(fā)揮的作用。細(xì)胞成像一般需要發(fā)生肽或蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)，才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的圖案化。利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)可以將烯基官能化（烯丙基和降冰片烯殘基）防污聚合物刷與細(xì)胞黏附肽RGD和精氨酸谷氨酸天冬氨酸纈氨酸偶聯(lián)后，可以觀察聚合物刷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用。另外，為了實(shí)現(xiàn)良好的細(xì)胞成像功能，可以在聚合物刷子的表面連接上光致發(fā)光肽，通過(guò)熒光顯微鏡和原子力顯微鏡能夠觀察到細(xì)胞微陣列［36］。含有烯基的四苯乙烯-馬來(lái)酰亞胺加合物是一種巰基特異性生物探針。當(dāng)這種生物探針暴露于含有巰基的L-半胱氨酸時(shí)，通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以產(chǎn)生易于觀察的熒光。因此可以利用四苯乙烯-馬來(lái)酰亞胺加合物作為可視化試劑對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，得到清晰的熒光圖像。這為描繪細(xì)胞中含有巰基的化合物的分布提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、特異、靈敏的熒光標(biāo)記方法［28］。利用硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將含有巰基的聚乙二醇有效地引入非熒光納米金剛石中，得到聚乙二醇化的熒光納米金剛石。這種復(fù)合材料顯示出高的水分散性、強(qiáng)的熒光性和低的細(xì)胞毒性，并具有良好的細(xì)胞染色性能，在生物成像方面顯示出巨大潛力［37］。

6 巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在納米材料的生物功能化中的應(yīng)用

隨著新型材料的特性不斷被發(fā)掘，納米材料作為其中一員，因其結(jié)構(gòu)龐大，負(fù)載能力高以及獨(dú)特且可調(diào)控的物理和化學(xué)性質(zhì)成為藥物遞送系統(tǒng)開(kāi)發(fā)中的重要工具。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)介導(dǎo)的納米材料藥物遞送技術(shù)也得到一定程度的發(fā)展。巰基烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以將具有巰基的各種化合物綴合到烯基官能化的硅納米顆粒的表面，而不影響硅納米顆粒的特征熒光性質(zhì)［38］。硫醇-烯烴點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以在大氣環(huán)境下功能化硅表面而不引入氧化硅，否則會(huì)對(duì)電子性能產(chǎn)生不利影響。有的研究學(xué)者在非常溫和的條件下利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)的方法將各種功能分子連接到無(wú)氧化物的Si（111）表面上，而不引入氧化硅。這種方法具有通用、有效、簡(jiǎn)便的和可模式化等特點(diǎn)，為生物功能電子學(xué)提供了新的途徑［39］。利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)可以將含有巰基的酶綴合到烯基官能化的硅納米晶體表面，得到得到生物無(wú)機(jī)雜化物。這種雜化物在緩沖液中分散性好、光穩(wěn)定性強(qiáng)，并且具有光致發(fā)光和催化活性，在硝基苯酯和尿素的化學(xué)檢測(cè)中具有潛在的應(yīng)用［40］。磁性納米顆粒與生物分子結(jié)合是一個(gè)很有前景的研究領(lǐng)域。利用巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)方法可以將納米磁性顆粒胺基原位官能化，可以得到能夠結(jié)合抗Englrailed-2蛋白的抗體的功能化磁性納米顆粒。共價(jià)鍵合法的固定效率比物理吸附法高（1.775 mg/g vs 0.54 mg/g）［41］。在微乳液中以肌紅蛋白為模版，利用硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備的分子印跡納米顆粒能夠選擇性的識(shí)別肌紅蛋白［42］。

7 展望

巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)因其簡(jiǎn)便性受到了科研工作者的青睞。巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的操作性強(qiáng)，產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，使其在聚合物科學(xué)和分子合成方面具有很大的潛力。然而巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用仍有一些不足之處：（1）目前合成含有雙鍵的單體或聚合物的方法已經(jīng)比較成熟，且得到的化合物種類豐富。而含有巰基的化合物的合成過(guò)程復(fù)雜，并且?guī)€基化合物結(jié)構(gòu)種類不足。這不利于了巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在生物傳感領(lǐng)域擴(kuò)大應(yīng)用范圍。因此，探索合成不同種類和官能度的巰基化合物是之后的研究重點(diǎn)之一。（2）對(duì)生物分子不同位置進(jìn)行官能團(tuán)標(biāo)記的成本較高也限制了巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)在生物傳感領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。（3）目前巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要集中于檢測(cè)小分子和核酸的熒光傳感器，導(dǎo)致傳感器的種類缺乏多樣性。因此，將巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)更多的應(yīng)用于其他類型生物傳感器是值得研究的方向，如光譜生物傳感器、可視顯色傳感器、仿生傳感器等。這將有助于拓寬巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的應(yīng)用范圍。（4）目前巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，還未在生物傳感領(lǐng)域達(dá)到大規(guī)?；瘧?yīng)用的階段。利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)搭載重現(xiàn)性好、靈敏、準(zhǔn)確的生物傳感器是實(shí)現(xiàn)商業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)的基礎(chǔ)。另外，基于巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)被較多的應(yīng)用于合成生物聚合物、功能化納米顆粒，以及檢測(cè)多種生物分子等方面，巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)具有應(yīng)用于化學(xué)和生物學(xué)前沿領(lǐng)域的巨大潛力。巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)還有可能更加深入的擴(kuò)展到材料科學(xué)領(lǐng)域，廣泛用于合成或功能化聚合物，并在涉及特殊性能材料的學(xué)科中具有廣闊的應(yīng)用前景。