酵母有絲分裂染色體異常分離機(jī)制

魏文青 謝澤雄

（天津大學(xué)化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津 300072）

有絲分裂過(guò)程發(fā)生染色體分離錯(cuò)誤，導(dǎo)致子代細(xì)胞增加或減少部分甚至整條染色體的現(xiàn)象稱為非整倍體化［1］。非整倍體是常見(jiàn)的細(xì)胞生理現(xiàn)象，存在于植物、動(dòng)物、真菌等生命體中，影響疾病發(fā)生、生物進(jìn)化、細(xì)胞應(yīng)激等過(guò)程［2］。比如常見(jiàn)的唐氏綜合征（21三體綜合征）和愛(ài)德華氏綜合癥（18三體綜合征）等非整倍體疾病的發(fā)生［3］。非整倍體誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性是驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤生長(zhǎng)的重要因素。酵母菌被廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等過(guò)程，在自然界中一般以單倍體或者二倍體形式存在［4-5］。非整倍體酵母細(xì)胞通常會(huì)表現(xiàn)出多種形式的基因組不穩(wěn)定性，如細(xì)胞內(nèi)染色體丟失頻率增加，有絲分裂重組事件以及DNA損傷修復(fù)缺陷等（圖1）。Deutschbauer等［6］對(duì)基因雜合缺失的二倍體釀酒酵母菌株進(jìn)行適應(yīng)性分析，以確定細(xì)胞中所有導(dǎo)致單倍劑量不足的生長(zhǎng)缺陷基因。通過(guò)將完整釀酒酵母菌株中測(cè)試得到的184個(gè)基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，這些基因處于雜合狀態(tài)時(shí)細(xì)胞的增殖能力會(huì)降低。所以非整倍體基因劑量的失衡會(huì)顯著降低細(xì)胞的適應(yīng)性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］。非整倍體釀酒酵母細(xì)胞還會(huì)出現(xiàn)明顯的G1期延遲，細(xì)胞的長(zhǎng)度發(fā)生變化等現(xiàn)象［8］。因此解析細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體異常分離的機(jī)制，對(duì)于調(diào)控細(xì)胞完成正常增殖過(guò)程，以及理解和治療非整倍體疾病都是至關(guān)重要的。

圖1 酵母非整倍體的形成及影響Fig.1 Formation and influence of yeast aneuploidy

酵母主要分為芽殖酵母和裂殖酵母，其中裂殖酵母主要通過(guò)有性繁殖和無(wú)性繁殖兩種方式進(jìn)行細(xì)胞分裂。通常在營(yíng)養(yǎng)環(huán)境充足的條件下，裂殖酵母主要通過(guò)有絲分裂的方式進(jìn)行一分為二的繁殖［9］，芽殖酵母主要通過(guò)出芽和接合兩種方式進(jìn)行繁殖，不同接合型的細(xì)胞既可以單獨(dú)進(jìn)行有絲分裂出芽繁殖，也可以與不同接合型細(xì)胞進(jìn)行接合并在一定的條件下開(kāi)始減數(shù)分裂過(guò)程［10］。故酵母在不同的繁殖方式中都有可能發(fā)生錯(cuò)誤，形成非整倍體細(xì)胞。其中芽殖酵母中比較典型的是釀酒酵母，綜合目前研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中主要通過(guò)“染色體提前分離”和“不分離”兩種方式形成非整倍體［11］。

1 有絲分裂過(guò)程染色體提前分離

染色體提前分離是指細(xì)胞有絲分裂中期染色體無(wú)法正確排列在赤道板上，姐妹染色單體出現(xiàn)提前分離的現(xiàn)象［12-14］。染色體提前分離的原因主要包括姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷和紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效。研究表明這兩種原因都會(huì)導(dǎo)致非整倍體子代細(xì)胞產(chǎn)生。

1.1 姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷

黏結(jié)蛋白是一種最早在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多亞基復(fù)合物，主要由Smc1、Smc3、Scc1和Scc3四個(gè)核心亞基組成，在姐妹染色單體的聚合、分離和DNA修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［14］。有絲分裂S期形成的姐妹染色單體被黏結(jié)蛋白聚合在一起，M期黏結(jié)蛋白被酶水解后姐妹染色單體在紡錘體的牽引下向細(xì)胞兩極移動(dòng)，若此過(guò)程黏結(jié)蛋白發(fā)生缺陷則會(huì)導(dǎo)致姐妹染色單體因黏聚力缺失而提前分離，隨后紡錘體與姐妹染色單體之間將會(huì)發(fā)生隨機(jī)結(jié)合，錯(cuò)誤的結(jié)合將會(huì)導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的產(chǎn)生［15］。

關(guān)于釀酒酵母細(xì)胞黏結(jié)蛋白如何將姐妹染色單體聚合的模型主要有3類，分別包括單環(huán)模型、雙環(huán)模型以及聚合桿狀模型。其中單環(huán)模型是最常見(jiàn)的模型，即Smc1、Smc3和Scc1/ Scc3形成一個(gè)大三角環(huán)狀黏結(jié)蛋白復(fù)合物，能夠環(huán)抱捕獲兩個(gè)長(zhǎng)度約為10 nm的姐妹染色單體［16］。黏結(jié)確立蛋白1（Eco1）是一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，是調(diào)節(jié)黏結(jié)蛋白形成的重要因子［17］。Eco1最早在酵母中鑒定成功，在有絲分裂S期促進(jìn)黏結(jié)蛋白亞基乙酰化修飾，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)束縛姐妹染色單體［18］。Zhang等［19］通過(guò)研究酵母細(xì)胞Smc3亞基上，受Eco1乙?；揎椀膬蓚€(gè)賴氨酸位點(diǎn)（K112和K113）突變的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Eco1對(duì)黏結(jié)蛋白的修飾作用受到突變的破壞，導(dǎo)致姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷，子代細(xì)胞出現(xiàn)非整倍體現(xiàn)象。

雙環(huán)模型，即每個(gè)黏結(jié)蛋白環(huán)都捕獲一個(gè)姐妹染色單體。當(dāng)兩個(gè)環(huán)產(chǎn)生橋接即Smc1和Smc3形成二聚體環(huán)產(chǎn)生內(nèi)聚力，將姐妹染色單體聚合［20］。同樣，Eco1/Ctf7乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的缺失也會(huì)顯著影響雙環(huán)模型中黏結(jié)蛋白聚合姐妹染色單體的效果［16］。Zhang等［21］利用酵母雙雜交測(cè)定法分析黏結(jié)蛋白復(fù)合物亞基之間的相互作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黏結(jié)蛋白復(fù)合物中不同亞基之間會(huì)出現(xiàn)共同免疫沉淀現(xiàn)象，但是當(dāng)每個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)則不顯示相似結(jié)果，這證明了雙環(huán)模型相比單環(huán)模型維持染色單體內(nèi)聚的靈活性更好。

聚合桿狀模型是指多個(gè)Smc1和Smc3組成的異源二聚體之間形成聚合桿狀環(huán)繞姐妹染色單體［22］。黏著蛋白與著絲粒特定作用的區(qū)域稱為染色體附著區(qū)。Surcel等［23］利用微染色體親和純化的方法，從芽殖酵母中分離出含有染色體附著區(qū)的微染色體，并利用透射電鏡拍攝和生化分析發(fā)現(xiàn)黏結(jié)蛋白是桿狀的，且與姐妹染色單體相互作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DNA的斷裂會(huì)直接影響聚合桿狀模型與微染色體的結(jié)合，說(shuō)明黏結(jié)蛋白與姐妹染色單體之間的聯(lián)系是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而不是簡(jiǎn)單的物理連接。因此黏結(jié)蛋白能夠行使正?；钚怨δ艿那疤崾潜ＷC黏結(jié)蛋白亞基的乙?；揎椷^(guò)程正常。未來(lái)關(guān)于黏結(jié)蛋白的研究還可以通過(guò)拓展新的方法，探尋并可視化黏結(jié)蛋白聚合姐妹染色單體的實(shí)際構(gòu)象。

1.2 紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效

紡錘體組裝檢查點(diǎn)（spindle assembly checkpoint，SAC）最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母細(xì)胞中，是一套精確的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)［24］。紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制通過(guò)監(jiān)控有絲分裂后期開(kāi)啟，確保啟動(dòng)前姐妹染色單體與紡錘體微管連接正確。釀酒酵母細(xì)胞中的獨(dú)立遺傳學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Mad1、Mad2、Mad3、Bub1和Bub3（紡錘體檢查點(diǎn)動(dòng)粒蛋白基因）基因參與酵母細(xì)胞紡錘體組裝監(jiān)控通路［25］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)紡錘體極復(fù)制基因（Msp1）和極光激酶B基因（AuroraB）也是SAC的組成成分［26］。有絲分裂前中期，Mad2基因編碼的蛋白能夠感應(yīng)細(xì)胞中未與紡錘體微管正確連接的動(dòng)粒發(fā)出的信號(hào)［27］。促進(jìn)后期復(fù)合體（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C），是指含有多個(gè)亞基的E3泛素連接酶，參與調(diào)控細(xì)胞周期從中期向后期過(guò)渡，是SAC激活的關(guān)鍵底物［28］。Mad1通過(guò)發(fā)生磷酸化改變Mad2的構(gòu)象，促使O-Mad2（Open-Mad2）轉(zhuǎn)化為具有穩(wěn)定活性的C-Mad2（Closed-Mad2）構(gòu)型，并結(jié)合APC/C的關(guān)鍵激活因子Cdc20形成有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物（MCC）［29-30］。MCC通過(guò)抑制APC/CCdc20的活性延遲酵母細(xì)胞有絲分裂后期的開(kāi)始（圖 2）［31］。

圖2 姐妹染色單體黏結(jié)蛋白與紡錘體監(jiān)控機(jī)制Fig.2 Sister chromatid adhesion protein and spindle monitoring mechanism

泛素化是指泛素分子特定連接蛋白Lys位點(diǎn)進(jìn)行的修飾作用。泛素化修飾過(guò)程主要有泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3三種酶參與，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化水平［32］。Reddy［33］等發(fā)現(xiàn)紡錘體檢查點(diǎn)的失效是一個(gè)耗能的過(guò)程，并依賴于APC/C的多泛素化過(guò)程。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)APC/C，觀察到APC/C發(fā)生多泛素化作用會(huì)導(dǎo)致Mad2從Cdc20上解離，使紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效。

磷酸化修飾是指將ATP的磷酸基團(tuán)加載到特定蛋白質(zhì)上的過(guò)程，需要磷酸轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控作用［34］。Wartrin等［35］發(fā)現(xiàn)發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞存活率會(huì)顯著降低且染色體變異事件增加，黏結(jié)蛋白在進(jìn)行細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的同時(shí)亞基Smc1和Smc3發(fā)生磷酸化作用，也會(huì)導(dǎo)致SAC功能缺陷。此外，Lopes等［36］發(fā)現(xiàn)SAC基因尤其關(guān)鍵組分（如Mad2）失活或表達(dá)不足也會(huì)導(dǎo)致SAC失效，進(jìn)而產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞甚至誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，有絲分裂過(guò)程中染色體的正常分離需要功能正常的SAC蛋白維持和調(diào)控。若SAC相關(guān)亞基的泛素化、磷酸化以及基因表達(dá)不足都會(huì)導(dǎo)致紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效，并對(duì)非整倍體現(xiàn)象普遍存在的癌癥的發(fā)生具有促進(jìn)作用［37］。

2 有絲分裂過(guò)程染色體不分離

有絲分裂過(guò)程染色體不分離是指細(xì)胞分裂后期姐妹染色單體無(wú)法正常分離，一起進(jìn)入相同子細(xì)胞核中，形成染色體數(shù)目不均等的子細(xì)胞［38］。總結(jié)介紹釀酒酵母有絲分裂染色體不分離的原因主要有兩個(gè)，動(dòng)粒與紡錘體微管連接錯(cuò)誤和多中心體途徑。其中動(dòng)粒與紡錘體連接錯(cuò)誤在酵母細(xì)胞中發(fā)生的頻率較高，相關(guān)的研究結(jié)果比較充分。多中心體途徑在一些疾病的發(fā)生過(guò)程中較為常見(jiàn)。

2.1 動(dòng)粒-紡錘體微管連接錯(cuò)誤

動(dòng)粒是著絲粒上的多亞基蛋白復(fù)合物，對(duì)于有絲分裂染色體的正確分離起著決定性作用［39］。Dam1復(fù)合體位于動(dòng)粒的外層，是動(dòng)粒的重要組分之一，在動(dòng)粒與微管之間起重要的連接作用［40］。動(dòng)粒在有絲分裂過(guò)程中的作用主要包括3個(gè)方面，（1）動(dòng)粒與染色體的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，即微管與動(dòng)粒正確連接且滿足張力時(shí)，染色體運(yùn)動(dòng)并促進(jìn)有絲分裂后期進(jìn)程的開(kāi)始；（2）紡錘體微管通過(guò)與動(dòng)粒連接捕獲姐妹染色體單體；（3）由動(dòng)粒通過(guò)感知微管連接的張力大小決定紡錘體檢查點(diǎn)的激活或沉默［41］。目前關(guān)于釀酒酵母動(dòng)粒的研究較為深入，許多組成動(dòng)粒模型的相關(guān)蛋白或者亞基都是高度保守的［42］。

有絲分裂早期動(dòng)粒與紡錘體微管的結(jié)合不穩(wěn)定，可能會(huì)發(fā)生連接錯(cuò)誤［43］。酵母細(xì)胞動(dòng)粒與微管錯(cuò)誤結(jié)合的方式主要有3種：Monotelic連接、Syntelic連接和Merotelic連接（圖3-a）。Monotelic連接（單極連接）是指有絲分裂中期一對(duì)姐妹染色體單體中只有一條染色體的動(dòng)粒與一極紡錘體微管連接，而另一條染色單體的動(dòng)粒沒(méi)有被紡錘體微管捕獲連接［44］。Cheeseman等［45］通過(guò)在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建熒光表達(dá)蛋白鑒定證明出4個(gè)組成Dam1復(fù)合體的新亞基，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)磷酸化的Dam1復(fù)合體不能及時(shí)建立正確的動(dòng)粒-微管連接，從而導(dǎo)致Monotelic連接在有絲分裂后期出現(xiàn)。

Syntelic連接（同極連接）是指一對(duì)姐妹染色單體的動(dòng)粒都與一側(cè)紡錘體微管連接。有絲分裂中期紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制在接收到Monotelic連接、Syntelic連接的信號(hào)后，會(huì)延遲細(xì)胞有絲分裂后期的開(kāi)始。若紡錘體組裝檢查點(diǎn)的功能失活，有絲分裂后期開(kāi)始前動(dòng)粒-微管的錯(cuò)誤連接則得不到糾正，最終會(huì)造成細(xì)胞有絲分裂后期一條甚至多條染色體不分離的現(xiàn)象［46］。極光激酶是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過(guò)程正確進(jìn)行的一類重要絲氨酸激酶，極光酶B在校正酵母細(xì)胞動(dòng)粒-微管連接錯(cuò)誤事件中發(fā)揮重要的作用［47］。缺陷的極光酶B無(wú)法感知?jiǎng)恿?微管中產(chǎn)生的張力變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞中出現(xiàn)Syntelic連接［48-49］。

Merotelic連接（梅洛蒂克連接）是指一對(duì)姐妹染色單體中有一個(gè)染色體的動(dòng)粒與兩極紡錘體微管都發(fā)生連接，且有絲分裂后期Merotelic連接的染色單體會(huì)依據(jù)連接兩極微管的多少進(jìn)行運(yùn)動(dòng)定位。Gregan等［50］認(rèn)為Merotelic連接是生物有絲分裂過(guò)程形成非整倍體的主要機(jī)制，同時(shí)也是促進(jìn)癌細(xì)胞染色體不穩(wěn)定的主要原因。所以動(dòng)粒與紡錘體微管之間正確連接的關(guān)鍵是動(dòng)粒能否正常發(fā)揮功能，以及感知?jiǎng)恿?微管連接張力變化的極光激酶是否可以正常接收信號(hào)。

2.2 多中心體途徑

中心體是主要的微管組織中心，不僅調(diào)控微管的成核運(yùn)動(dòng)，而且推動(dòng)著細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程［51］。每個(gè)細(xì)胞周期中心體僅復(fù)制一次，復(fù)制形成的兩個(gè)中心體產(chǎn)生微管并移動(dòng)到細(xì)胞兩極。若細(xì)胞不能正確調(diào)控中心體的復(fù)制將會(huì)出現(xiàn)中心體數(shù)目異?，F(xiàn)象［52-54］。當(dāng)細(xì)胞中中心體數(shù)量超過(guò)兩個(gè)時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)紡錘絲與動(dòng)粒之間短暫的多極連接，姐妹染色單體因受力不均勻分離形成非整倍體子細(xì)胞［55］（圖 3-b）。

圖3 動(dòng)粒-微管結(jié)合錯(cuò)誤和多中心體途徑Fig.3 Miscellaneous kinetochore-microtubule binding and polycentric pathway

多中心體產(chǎn)生的原因主要包括：中心體擴(kuò)增、中心粒聚合缺陷以及中心體片段化［56］。Polo樣蛋白激酶4（PLK4）是參與調(diào)控中心體復(fù)制過(guò)程的重要組分，當(dāng)PLK4過(guò)表達(dá)時(shí)中心體復(fù)制機(jī)制會(huì)發(fā)生缺陷，將會(huì)導(dǎo)致一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)中心體發(fā)生多次復(fù)制［57-58］。Meraldi等［59］進(jìn)行細(xì)胞中心體復(fù)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E2F轉(zhuǎn)錄因子和Cdk2-周期蛋白A活性的激活也是中心體復(fù)制必須的。所以這些蛋白或因子的過(guò)表達(dá)都有可能促使細(xì)胞內(nèi)中心體的擴(kuò)增。

然而當(dāng)細(xì)胞中某些蛋白表達(dá)不足時(shí)，中心粒之間的聚合張力會(huì)降低甚至消失，導(dǎo)致中心粒聚合發(fā)生缺陷［60］。此外，中心體結(jié)構(gòu)的缺陷可能導(dǎo)致片段化的中心粒與微管連接形成極紡錘體［57］。以上3種多中心產(chǎn)生的機(jī)制都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生多極分裂，即有絲分裂過(guò)程形成3個(gè)甚至更多個(gè)子細(xì)胞核。很多研究表明多極分裂最終導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的產(chǎn)生，尤其在多種癌癥的發(fā)生中較為明顯［61］。

3 總結(jié)與展望

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)酵母有絲分裂過(guò)程中染色體異常分離機(jī)制的研究已經(jīng)有了顯著的成果。從最初的細(xì)胞學(xué)觀察到如今深層次的遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)很多蛋白和調(diào)節(jié)因子參與有絲分裂染色體分離，并且起到密切的調(diào)控作用。但是綜合目前的研究會(huì)發(fā)現(xiàn)還有很多蛋白或亞基的作用機(jī)制未闡釋清晰，如調(diào)節(jié)動(dòng)粒-微管連接的Dam1復(fù)合體相關(guān)亞基。此外，是否還有新的調(diào)控蛋白或通路未發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究者而言也是一個(gè)挑戰(zhàn)。其次，染色體分離異常直接導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生?，F(xiàn)有的研究都表明非整倍體是癌癥細(xì)胞的顯著特征，增加了癌細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，但是非整倍體與腫瘤發(fā)生的關(guān)系亟待進(jìn)一步的研究闡明。最后，在酵母細(xì)胞中染色體分裂異常也會(huì)導(dǎo)致多倍體細(xì)胞的形成，但是多倍體細(xì)胞與非整倍體細(xì)胞之間的調(diào)控關(guān)系仍是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。系統(tǒng)且全面的了解和建立不同物種非整倍體形成方式及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是必要的，縮小研究的成本及時(shí)間范疇，探尋和解釋細(xì)胞有絲分裂染色體分離異常的原理，并應(yīng)用其解決與人類息息相關(guān)的實(shí)際問(wèn)題是本研究的終極任務(wù)。