兩種國(guó)產(chǎn)與一種進(jìn)口小鼠肝炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的比較研究

方 姣 梁錦寧 方 茜 朱康立 黃海娜 羅秋琳 潘炫孝 郭曉萍

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021)

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)屬于冠狀病毒科，是一種高度傳染性疾病[1]。MHV是《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》(GB 14922.2—2011)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必檢項(xiàng)目，是我國(guó)清潔級(jí)或以上級(jí)別實(shí)驗(yàn)小鼠應(yīng)排除的病原之一。目前，病毒性病原體的檢測(cè)方法多采取血清學(xué)方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒檢測(cè)方法》(GB/T14926.22—2001)規(guī)定的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)(IFA)和免疫酶實(shí)驗(yàn)(IEA)。根據(jù)張志妮等[2]報(bào)道，對(duì)于日常大量樣本的MHV快速檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)單位一般采用ELISA初篩，陽性樣本用IFA進(jìn)行復(fù)檢[2]。因此，選擇合適的ELISA檢測(cè)試劑盒尤為關(guān)鍵。檢測(cè)用試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)檢測(cè)質(zhì)量有極大的影響，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確起著決定性作用。檢測(cè)方法、技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化保證研究成果的可靠性和科學(xué)性。歐美等國(guó)家已研制出了系列化和商品化的高質(zhì)量檢測(cè)試劑盒，但是國(guó)內(nèi)檢測(cè)試劑提供單位集中在2～3家，且側(cè)重不同的方法，可選擇性較小[3]。我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心目前使用的ELISA試劑盒為美國(guó)進(jìn)口，價(jià)格昂貴且貨期長(zhǎng)，因此不能滿足突發(fā)情況下的緊急需求。本研究擬對(duì)國(guó)內(nèi)兩種MHV抗體ELISA試劑盒和國(guó)外一種同類試劑盒的靈敏度、特異性、精密性和可信度進(jìn)行比較，篩選出既經(jīng)濟(jì)又可靠且適合我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的檢測(cè)試劑盒，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

A和B兩種國(guó)產(chǎn)MHV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒；進(jìn)口MHV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)EBI-Xpress Biotech International；2019年國(guó)內(nèi)送檢結(jié)果為陰性的10份陰性血清和10份陽性血清來源于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，型號(hào)：Multiskan GO)；移液槍(Eppendorf，型號(hào)：Eppendorf Research Plus)；離心機(jī)(Beckman coulter，型號(hào)：Allegra 30R)；37 ℃培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DHG-9070)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)操作及判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

分別根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定判斷標(biāo)準(zhǔn)。

①國(guó)產(chǎn)MHV抗體ELISA檢測(cè)A試劑盒(以下簡(jiǎn)稱國(guó)產(chǎn)A)：在陰性和陽性對(duì)照(陽性對(duì)照孔平均值≥1.00，陰性對(duì)照孔平均值≤0.20)成立的情況下，臨界值=陰性對(duì)照孔(平均值+0.15)；待檢血清特異抗原孔A值<臨界值時(shí)，判為陰性；待檢血清特異抗原孔A值≥臨界值時(shí)，判為陽性；②國(guó)產(chǎn)MHV抗體ELISA檢測(cè)B試劑盒(以下簡(jiǎn)稱國(guó)產(chǎn)B)：在陰性、陽性對(duì)照(陽性對(duì)照的陽性孔與陰性孔的差值≥0.6，陰性對(duì)照的陽性孔與陰性孔的差值≤0.25)成立的情況下，待檢血清陽性孔與陰性孔的差值<0.3時(shí)，判為陰性；待檢血清陽性孔與陰性孔的差值≥0.3，判為陽性；③進(jìn)口MHV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(以下簡(jiǎn)稱進(jìn)口)，在陰性、陽性對(duì)照(陽性對(duì)照的陽性孔與陰性孔的差值≥0.6，陰性對(duì)照的陽性孔與陰性孔的差值≤0.25)成立的情況下：待檢血清陽性孔與陰性孔的差值<0.3，判為陰性；待檢血清陽性孔與陰性孔的差值≥0.3，判為陽性。

1.3.2敏感性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)王吉等[4]報(bào)道，MHV陽性血清從1∶50依次倍比稀釋到1∶12 800，樣品設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，按照以上三種試劑盒各自的判斷標(biāo)準(zhǔn)，最大稀釋比例的陽性孔為其檢測(cè)靈敏度。

1.3.3特異性實(shí)驗(yàn)：三種試劑盒分別檢測(cè)試劑盒內(nèi)的陽性對(duì)照，即：MHV、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠細(xì)小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼腸孤Ⅲ型病毒(Reo-3)。設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，在陰性和陽性對(duì)照均成立的情況下，觀察每種試劑盒與除MHV外的5種病毒有無交叉反應(yīng)。

1.3.4精密性實(shí)驗(yàn)：同一批次試劑盒，對(duì)同一份陽性血清在同一稀釋度下同時(shí)檢測(cè)20孔，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)。

1.3.5可信度實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)上述10份陽性血清和10份陰性血清，驗(yàn)證國(guó)產(chǎn)A、國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口三種試劑盒的可信度。

1.3.6統(tǒng)計(jì)方法：對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 敏感性實(shí)驗(yàn)

國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口試劑盒對(duì)試劑盒陽性對(duì)照血清檢測(cè)，從表1檢測(cè)結(jié)果得出，國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒檢測(cè)靈敏度均較高，差異顯著(P<0.05)，且進(jìn)口試劑盒是國(guó)產(chǎn)試劑盒B的4倍。

表1 敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

每種試劑盒分別檢測(cè)各自攜帶的陽性對(duì)照，即：除MHV外的SV、PVM、MVM、MPV及Reo-3病毒陽性血清。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)A檢測(cè)上述病毒陽性血清皆為陽性，說明該試劑盒與此5種病毒陽性血清存在交叉反應(yīng)；國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說明兩種試劑盒與此5種病毒均無交叉反應(yīng)。

2.3 精密性實(shí)驗(yàn)

三種試劑盒精密性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2。國(guó)產(chǎn)A的批內(nèi)變異系數(shù)為13.825%，國(guó)產(chǎn)B的批內(nèi)變異系數(shù)為13.827%，進(jìn)口的批內(nèi)變異系數(shù)為5.667%。

表2 精密性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 可信度實(shí)驗(yàn)

國(guó)產(chǎn)A中10個(gè)陽性血清中有6個(gè)陽性樣品未被檢出，其檢測(cè)符合率為40%，而10個(gè)陰性樣品有兩個(gè)檢出為陽性，檢測(cè)符合率為80%。國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒對(duì)10個(gè)陽性樣品均檢出了陽性，對(duì)10個(gè)陰性樣品均檢出了陰性，檢測(cè)符合率均為100%，結(jié)果如表3。

表3 ELISA檢測(cè)已知MHV抗體陰性及陽性血清結(jié)果

3 討論

MHV具有極高傳染性。根據(jù)仇保豐等[5]報(bào)道，當(dāng)感染小鼠群免疫功能下降時(shí)，即可能引起整個(gè)鼠群爆發(fā)性的急性感染，導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)和相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，定期檢測(cè)MHV，及時(shí)淘汰感染動(dòng)物，可以避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失。在實(shí)際應(yīng)用中，通常采用ELISA初篩，針對(duì)初篩中的可疑樣本，進(jìn)一步用其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定其準(zhǔn)確結(jié)果。

檢測(cè)進(jìn)口陽性對(duì)照血清靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示：國(guó)產(chǎn)A和國(guó)產(chǎn)B分別為1∶1和1∶400，進(jìn)口為1∶1 600，說明國(guó)產(chǎn)A靈敏度很低，國(guó)產(chǎn)B與進(jìn)口檢測(cè)進(jìn)口陽性血清靈敏度均較高(均達(dá)到1∶400以上)，進(jìn)口試劑盒陽性血清靈敏度比國(guó)產(chǎn)B高4倍。特異性實(shí)驗(yàn)顯示：國(guó)產(chǎn)A對(duì)SV、MPV、PVM、MVM及Reo-3皆檢出為陽性，說明此類試劑盒的特異性差；國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒對(duì)上述5種陽性血清皆檢出陰性，表明進(jìn)口的試劑盒特異性良好。精密性實(shí)驗(yàn)顯示：國(guó)產(chǎn)A的批內(nèi)變異系數(shù)為13.825%，國(guó)產(chǎn)B的批內(nèi)變異系數(shù)為13.827%，兩種國(guó)產(chǎn)試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)均大于10%，說明國(guó)產(chǎn)A和國(guó)產(chǎn)B的精密性較差。進(jìn)口試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)為5.667%小于10%，說明進(jìn)口試劑盒精密性良好。三者精密性的優(yōu)劣順序依次為：進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)A及國(guó)產(chǎn)B?？尚哦葘?shí)驗(yàn)顯示：國(guó)產(chǎn)A試劑盒陽性檢測(cè)符合率為40%，陰性檢測(cè)符合率為80%。國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒陰性和陽性檢測(cè)符合率均為100%，說明國(guó)產(chǎn)A試劑盒的可信度低，國(guó)產(chǎn)B和進(jìn)口試劑盒的可信度高。

通過以上研究得到三種試劑盒在靈敏性、特異性、精密度和可信度方面的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，最終篩選到國(guó)產(chǎn)B試劑盒既經(jīng)濟(jì)又可靠且適合我校動(dòng)物中心使用的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的國(guó)產(chǎn)MHV抗體檢測(cè)試劑盒。