黃甲軟肝顆粒對(duì)人血白蛋白致免疫性肝纖維化模型大鼠的影響

高曉新 朱春玥 張茜茜 王佳帥 曹春然 胡宇馳 李雪梅

(北京市藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

肝纖維化是一種繼發(fā)于多種急慢性肝損傷后的自我修復(fù)機(jī)制[1]，是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必然共同病理過(guò)程[2]。現(xiàn)今肝纖維化的發(fā)生率逐年增加，嚴(yán)重威脅著人體健康和生命安全[3]。由于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)診斷肝纖維化屬于“積聚”、 “脅痛”、“臌脹”的病理范疇, 并無(wú)“肝纖維化”一詞, 中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化的基本病機(jī)為正虛血瘀, 基本證型為氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)，故對(duì)此癥以濕熱、氣血蘊(yùn)結(jié)進(jìn)行治療, 療效尤以活血化瘀類中藥材和有效單體成分對(duì)肝纖維化的效果最佳[4-5]?；谥嗅t(yī)中藥的理氣疏肝、活血軟堅(jiān)的理論，黃甲軟肝顆粒用黃芪、葛根、靈芝、鱉甲、三七等中藥為主要成分進(jìn)行組方。本研究通過(guò)建立免疫性肝纖維化大鼠模型來(lái)檢驗(yàn)黃甲軟肝顆粒對(duì)肝纖維化的治療作用。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

黃甲軟肝顆粒干膏粉，購(gòu)自A公司，批號(hào)：HJ170206，用純水配制濃度分別為1.44 g/mL、0.72 g/mL及0.36 g/mL；復(fù)方鱉甲軟肝片，購(gòu)自B廠，批號(hào)：20170604，做為陽(yáng)性藥用純化水配制成濃度為0.14 g/mL；人血白蛋白(human serum albumin,HSA)，批號(hào)：L3844411 A，CSL Behring GmbH.；弗氏完全佐劑，批號(hào)：057K9904，Sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，體質(zhì)量280～310 g，SPF級(jí)，雄性，72只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0033。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)北京市藥品檢驗(yàn)研究院倫理審查，審查編號(hào)：ZT-2017-006。

1.3 儀器

AU400型生化儀購(gòu)自O(shè)LYMPUS；XH6080 γ計(jì)數(shù)器購(gòu)自西核儀廠；Typ3151準(zhǔn)自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自Lumino。

1.4 造模

1.4.1HSA致免疫性肝纖維化大鼠模型的致敏階段[6]：雄性Wistar大鼠72只，按體質(zhì)量隨機(jī)分出12只為陰性對(duì)照組動(dòng)物，其余60只動(dòng)物進(jìn)行造模。實(shí)驗(yàn)第1天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與弗氏完全佐劑等體積混合溶液;實(shí)驗(yàn)第14天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與不完全弗氏佐劑等體積混合溶液;實(shí)驗(yàn)第24天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與1/2體積不完弗氏佐劑混合溶液;實(shí)驗(yàn)第34 天大鼠腹股溝皮下注射不加佐劑的HSA。每只動(dòng)物的致敏劑量8 mg/mL。

1.4.2HSA致免疫性肝纖維化大鼠模型的激發(fā)階段：末次致敏后10 d，對(duì)大鼠(除陰性對(duì)照組外)腹腔注射ALB進(jìn)行激發(fā)，2次/周，共8周。激發(fā)劑量分別為：第1周，每次2.5 mg/mL；第2周，每次5 mg/mL；第3～8周，每次10 mg/mL。

1.5 分組與給藥

末次激發(fā)1周后，測(cè)定造模動(dòng)物血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)。根據(jù)測(cè)得的血清ALT值，將造模動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即模型組、陽(yáng)性藥組(復(fù)方鱉甲軟肝片，1.4 g/kg)、黃甲軟肝高、中、低劑量組(14.4 g生藥/kg、7.2 g生藥/kg、3.6 g生藥/kg，分別相當(dāng)于臨床用藥劑量的2倍、1倍和0.5倍,以下簡(jiǎn)稱高劑量組、中劑量組和低劑量組)。每組12只，各組給藥1次/d，給藥體積為1 mL/100 g，連續(xù)給藥4周，模型組和陰性對(duì)照組給予同體積的純水。

1.6 相關(guān)測(cè)定指標(biāo)[7]

給藥結(jié)束后，各組動(dòng)物測(cè)定血清中TP、ALB、ALT和AST、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)，計(jì)算A/G比值。摘取肝臟和脾臟稱質(zhì)量，計(jì)算上述指數(shù)(g/100 g)。

選取相同部位肝臟制作蘇木素-伊紅(HE)切片，每片隨機(jī)選取三個(gè)視野，分別按照如下標(biāo)準(zhǔn)記錄肝纖維化病理分級(jí)，并取平均值作為該動(dòng)物肝臟的病理分級(jí)依據(jù)[5]。

肝纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：

0級(jí)：肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)纖維組織增生。

1級(jí)：膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍向外延伸，但未包繞整個(gè)肝小葉。

2級(jí)：膠原纖維延伸、相互連接，包繞整個(gè)肝小葉。

3級(jí)：膠原纖維包繞并分割肝小葉，以致正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，但以大方形假小葉為主。

4級(jí)：肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，假小葉形成，小圓形假小葉>50%，假小葉間有粗大增生的膠原纖維。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝、脾質(zhì)量和系數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物的肝、脾系數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組，差異極顯著性(P<0.01)，說(shuō)明HSA致大鼠肝臟形成免疫性肝纖維化造模成立。與模型組比較，黃甲軟肝三個(gè)劑量組肝、脾系數(shù)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1)。

表1 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝、脾系數(shù)的影響

2.2 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝纖維化標(biāo)志物含量的影響

大鼠血清肝纖維化標(biāo)志物含量如圖1所示，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠血清HA、LN和Ⅳ-C含量均顯著升高(P<0.01～0.05)；與模型組比較，三個(gè)劑量組血清HA的含量顯著降低(P<0.01～0.05)，高劑量組血清LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量顯著降低(P<0.05)。

圖1 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠血清中HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C的影響

2.3 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

結(jié)果如圖2所示，與陰性對(duì)照組比較，模型組ALT和AST顯著升高(P<0.01～0.05)；與模型組比較，高劑量組血清ALT顯著降低(P<0.05)，高劑量組與低劑量組血清AST顯著降低(P<0.01～0.05)。

圖2 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠血清中ALT、AST、TP、ALB及A/G的影響

2.4 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

陰性對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，模型組肝臟纖維組織增生、小葉間隔破壞、假小葉形成以及小膽管增生，病變分級(jí)(表2)較陰性對(duì)照組顯著增大(P<0.01)；陽(yáng)性藥組、高劑量組及中劑量組肝臟纖維成分增多且呈現(xiàn)出由匯管區(qū)及中央靜脈向外伸展、有的形成纖維間隔，但病變程度比模型組輕，病變分級(jí)與模型組比較減小，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01～0.05)。低劑量組與模型組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其病理組織觀察顯示纖維化程度有減輕的趨勢(shì)。

表2 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

3 討論

各種肝損害均可引起肝細(xì)胞的壞死、再生，進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化[8]。常用四氯化碳(CCl4)和HSA造大鼠肝纖維化模型，兩模型在死亡率、血清生化及病理形態(tài)上表現(xiàn)大體一致，但機(jī)制各不相同[9]。與臨床肝纖維化機(jī)制相似，HSA模型為Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)，主要在肝門(mén)脈匯管區(qū)形成免疫復(fù)合物沉積，從而引起局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步刺激膠原增生而造成肝纖維化[10-11]。此模型主要表現(xiàn)為血清TP、ALT、AST、HA和PCⅢ水平升高，ALB、A/G及Ⅳ型膠原-C水平下降，肝、脾臟指數(shù)上升。

纖維化的病因和表型不同，治療策略也不同[12]；聯(lián)合用藥在臨床研究中顯示出了高效低毒的優(yōu)勢(shì)[13]。中醫(yī)理論認(rèn)為肝纖維化是氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)所致，從“瘀”與“虛”方面探索發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、 黃芪總皂苷及黃芪甲苷具有降低肝纖維化大鼠肝功指標(biāo)和組織病理?yè)p傷的作用[15-18]，葛根素也具有一定的抗肝纖維化作用[19-20]?；谘芯亢椭嗅t(yī)理論組方黃甲軟肝顆粒，主要成分為黃芪、葛根、三七、靈芝、鱉甲等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃甲軟肝三個(gè)劑量組均能明顯降低血清HA的含量，高劑量能明顯降低血清LN、ALT、AST含量及PCⅢ的水平;高、低劑量組能顯著降低血清AST含量；高、中劑量組明顯減輕模型大鼠肝臟纖維化病理形態(tài)改變。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠HSA致免疫性肝纖維化有一定的療效，為其臨床使用提供依據(jù)。