楊樹PR10基因應(yīng)答楊樹葉枯病與非生物脅迫表達(dá)1)

張弛 王宇婷 顧詠梅 賈豐璘 周博如

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150000)

病程相關(guān)蛋白(PRP或PRs)是植物應(yīng)對(duì)外界非生物與生物脅迫環(huán)境，誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白[1-2]。其中，植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)主要受ABA-依賴、ABA-非依賴2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)在抵御生物脅迫中發(fā)揮重要功能，這些激素間往往形成1個(gè)具有協(xié)同、拮抗作用的交叉通路網(wǎng)絡(luò)，最終誘導(dǎo)并激活一系列防御相關(guān)基因的表達(dá)[3]。PR蛋白主要分為17個(gè)家族,廣泛存在于開花植物中, 是植物防衛(wèi)系統(tǒng)的重要組成部分[4]。在病原體侵染、非生物脅迫及相關(guān)信號(hào)分子、過敏性壞死反應(yīng)、系統(tǒng)獲得性抗性進(jìn)程中，PR蛋白會(huì)不斷產(chǎn)生、積累，繼而在植物抵御生物及非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[4-5]。第一個(gè)PR10基因是1988年從歐芹中分離鑒定的，其重要特征是具有1個(gè)P環(huán)的富含甘氨酸保守結(jié)構(gòu)域(GxGGxGxxK)，該結(jié)構(gòu)域影響PR10蛋白的核酸酶活性。PR10蛋白另一特征是可形成1個(gè)Y型疏水腔，疏水腔參與脂肪酸、細(xì)胞分裂素、多類黃酮類化合物等非極性配體的胞內(nèi)運(yùn)輸[5]。PR10蛋白疏水腔通過形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化與不同配體結(jié)合，在植物防御、生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮作用[6-7]。葡萄PR10蛋白具有核酸酶活性[8]。PR10基因可通過染色體簇的形式進(jìn)行多拷貝復(fù)制，從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及適應(yīng)不利環(huán)境[9]。RSOsPR10是一種新的水稻PR10蛋白，在鹽和稻瘟病感染時(shí)，可通過茉莉酸信號(hào)通路被激活，迅速在根中表達(dá)[10]。楊樹具有生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、分布范圍廣、材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，是我國重要的綠化、造林、用材樹種。在我國，土壤鹽堿化及楊樹相關(guān)病害嚴(yán)重影響了楊樹的生存、生長發(fā)育，成為限制楊樹生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)應(yīng)用的因素[11]。通過研究楊樹在高鹽、生物脅迫及相關(guān)信號(hào)分子環(huán)境的表達(dá)特點(diǎn)，可為改良楊樹抗逆能力、擴(kuò)大楊樹栽培范圍，提高我國林業(yè)的生產(chǎn)潛力提供思路。

本研究為探明小黑楊PR10基因應(yīng)答高鹽、生物脅迫及相關(guān)信號(hào)分子環(huán)境下的表達(dá)特點(diǎn)，從小黑楊(Populussimonii×P.nigra)中克隆PR10基因cDNA片段，對(duì)PR10基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用RT-qPCR分析PR10基因在鹽(NaCl)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸、楊樹葉枯病病原菌脅迫條件時(shí)的表達(dá)特性，為探明PR10基因在楊樹抗逆中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 目的基因的克隆和表達(dá)分析

將來自同一無性系的雙單倍體小黑楊組培苗進(jìn)行擴(kuò)繁，將生長1個(gè)月的組培苗洗掉培養(yǎng)基，在相對(duì)濕度為 60%～70%、14 h光/10 h暗、平均溫度25 ℃條件下繼續(xù)水培1個(gè)月。將材料分為5組，每組分為0、12、24、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別用水(對(duì)照組)、150 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1水楊酸、150 mmol·L-1茉莉酸甲酯脅迫，并使用葉枯病菌餅進(jìn)行接種[12-13]脅迫。處理0、12、24、48 h后，采集小黑楊的根、葉放入液氮速凍，于冰箱-80 ℃保存。

根據(jù)楊樹基因組數(shù)據(jù)庫信息、基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物(表1)，以Actin(基因登錄號(hào):JM986590)為內(nèi)參引物進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程公司測序。使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取小黑楊總RNA，通過Primer Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個(gè)處理包含3個(gè)生物重復(fù)。用無菌水將cDNA質(zhì)量濃度稀釋至(100±1)ng·μL-1，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。采用SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒并參照說明書配置反應(yīng)體系(表2)進(jìn)行試驗(yàn)。用美國 Thernofisher ABI-7500熒光PCR儀進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋弘A段一——95 ℃、30 s；階段二——95 ℃、 5 s，60 ℃、34 s，循環(huán)40次；階段三—— 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。通過2- ΔΔCT公式計(jì)算目的基因在不同樣品的相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用鄧肯氏新復(fù)極差法分析差異顯著性。

表2 PR-PCR反應(yīng)體系

1.2 生物信息學(xué)分析

分別用ExPasy(http://web.expasy.org/protparam)在線Protparam軟件、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)的Kyte and Doolittle算法、Singa-P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、TMPred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html#opennewwindow)對(duì)PR10蛋白氨基酸的理化性質(zhì)、PR10蛋白的親水性、PR10蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。用SOMPA、swissmodel(http://swissmodel.expasy.org)預(yù)測PR10蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)PR10蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)。使用MEGA-X(Version 10.0.5)軟件選擇Neighbor-joining模式并將設(shè)bootstrap replications設(shè)定為500次構(gòu)建進(jìn)化樹，用在線預(yù)測軟件Yloc(https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析[11]。

1.3 PBI121-GFP-PR10植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)載體PBI121-GFP與目的基因PR10基因序列，設(shè)計(jì)含Spe1單酶切位點(diǎn)的酶切引物(表1)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆。將PR10基因片段定向插入PBI21-GFP載體，構(gòu)建GFP-PR10融合蛋白表達(dá)載體，選陽性克隆菌液送至上海生工生物工程公司測序。

表1 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)

1.4 基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

利用基因槍法對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。將V(鎢粉)∶V(0.1 mol·L-1亞精胺)∶V(2.5 mol·L-1氯化鈣 )∶V(1 μg·uL-1質(zhì)粒)=50∶20∶50∶5 混合，通過渦旋振蕩、離心、懸浮等步驟，最后使用無水乙醇與微?；靹?，制備成微載體。參考PDS-1000臺(tái)式基因槍使用說明，在氣壓值達(dá) 1 300 psi 時(shí)進(jìn)行基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的洋蔥表皮暗培養(yǎng)24 h后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PR10基因克隆及氨基酸理化性質(zhì)

從小黑楊cDNA中克隆獲得的PR10基因片段，長度為477 bp，編碼158個(gè)氨基酸，含20種氨基酸，具完整的開放閱讀框。PR10蛋白的分子量為17.6 KDa，等電點(diǎn)為5.20，不穩(wěn)定系數(shù)為34.32，屬于穩(wěn)定蛋白。PR10蛋白總平均疏水指數(shù)為-0.186，親水性區(qū)域分布均勻，氨基酸數(shù)量較多，為親水蛋白(圖1)。在線軟件SOPMA對(duì)楊樹PR10蛋白氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示(圖2)，該蛋白含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈無規(guī)則卷曲(表3)。在線軟件swissmodel預(yù)測得到圖3所示楊樹PR10蛋白三維結(jié)構(gòu)。

圖3 PR10蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

表3 PR10蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖1 PR10蛋白氨基酸親疏水性區(qū)域分布圖

序列位置

2.2 信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

信號(hào)肽是N端引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的一段氨基酸序列，通常由20～30個(gè)氨基酸殘基組成。信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果表明，PR10蛋白不存在信號(hào)肽(圖4)。跨膜結(jié)構(gòu)是一段一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸組成的片段，主要形成α-螺旋。根據(jù)在線工具TMPred預(yù)測PR10蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，該基因蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖4 小黑楊PR10蛋白信號(hào)肽預(yù)測

圖5 小黑楊PR10蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

2.3 同源性分析

將小黑楊PR10基因與其他同源蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。結(jié)果顯示，小黑楊PR10與來自毛果楊(Populustrichocarpa)、毛白楊(Populustomentosa)的PRs蛋白親緣關(guān)系較近，聚成一類。而與木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)、葡萄(Vitisvinifera)、歐洲水青岡(Fagussylvatica)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)的PRs蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建GFP-PR10融合表達(dá)載體，用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察其亞細(xì)胞定位(圖7)。結(jié)果表明，對(duì)照GFP載體在整個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞中均有表達(dá)，而GFP-PR10融合蛋白表達(dá)載體只能在細(xì)胞核中看到綠色熒光。說明PR10定位于細(xì)胞核中，這與在線預(yù)測軟件Yloc預(yù)測分析結(jié)果一致。

A、D為暗場觀察；B、E為明場觀察；C、F為二者結(jié)合效果。

2.5 PR10基因差異表達(dá)分析

在正常條件時(shí)，PR10基因在楊樹葉片、根系中均有表達(dá)，在根系中的表達(dá)水平明顯高于在葉片中的表達(dá)水平(表4)。PR10基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，葉枯病病原菌、NaCl、水楊酸、茉莉酸甲酯均能引起PR10基因上調(diào)表達(dá)。在葉枯病病原菌脅迫時(shí)，PR10基因在葉中的表達(dá)水平明顯升高，在48 h的表達(dá)水平約為非脅迫對(duì)照表達(dá)水平的8.86倍。PR10基因在根中表達(dá)水平隨脅迫時(shí)間延長，表達(dá)水平有下降的趨勢，但和對(duì)照相比未達(dá)到顯著差異水平。受到鹽脅迫時(shí)，PR10基因在葉片、根中的表達(dá)水平顯著提高，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。鹽脅迫下PR10基因在根中12 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最大，約為非脅迫對(duì)照表達(dá)水平的15.25倍；在葉中表達(dá)水平于12 h時(shí)達(dá)到峰值，約為非脅迫對(duì)照表達(dá)水平的2.64倍。水楊酸、茉莉酸甲酯脅迫時(shí)，PR10基因在根、葉中的表達(dá)水平及變化趨勢與其在鹽脅迫時(shí)的表達(dá)趨勢相似，水楊酸脅迫使根中PR10基因在24 h時(shí)達(dá)到最大值，表達(dá)水平提高3.75倍；茉莉酸甲酯脅迫使根中PR10基因在12 h時(shí)達(dá)到最大值，相對(duì)表達(dá)量提高8.29倍。上述結(jié)果說明，PR10基因表達(dá)具有組織特異性，并受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

表4 PR10基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

病程相關(guān)蛋白是植物在受到外源病原體入侵時(shí)，體內(nèi)會(huì)通過一系列應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)的一類蛋白[14]。PR蛋白在植物的生長發(fā)育和應(yīng)對(duì)生物、非生物脅迫時(shí)起到非常重要的作用。PR蛋白分為17個(gè)家族，PR10蛋白是其中具有核酸酶或者合成酶活性的1個(gè)家族。PR10蛋白能在病毒、細(xì)菌、真菌等生物脅迫條件和非生物脅迫時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)脅迫信號(hào)被植物細(xì)胞表面受體感知，受體會(huì)被激活進(jìn)而引發(fā)信號(hào)初級(jí)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，胞內(nèi)產(chǎn)生Ca2+、ROS、cAMP等第二信使，并將信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，通過JA/SA、ABA-依賴、ABA-非依賴的信號(hào)通路激活WRKY、bZ1P、DREB、MYB等諸多轉(zhuǎn)錄因子，特異性識(shí)別啟動(dòng)子上的ACCTGACC序列、WRKY、W-box、DRE元件等保守結(jié)構(gòu)域并相結(jié)合起到調(diào)控PR10基因表達(dá)的效果[15]。

PR10基因能在生物脅迫下誘導(dǎo)并參與防御反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，PR10蛋白在甘蔗黑穗病(Sporisoriumscitamineum)脅迫時(shí)能提高葉片細(xì)胞中H2O2的積累水平，并增強(qiáng)其對(duì)青枯病菌、綠膿桿菌侵染的抗性[16]。在被真菌炭疽病菌侵染時(shí)，PR10蛋白積累在白羽扇豆(Lupinusalbus)植株的葉片中[17]。在水稻中，稻瘟病菌感染葉片的試驗(yàn)表明，RPR10a在對(duì)病菌的反應(yīng)中以局部方式表達(dá)最強(qiáng)烈[18]。本研究中，楊樹在接種楊葉枯病后，葉片中PR10基因表達(dá)量在48 h內(nèi)迅速增加并積累，參與植物的防御反應(yīng)。

PR10基因表達(dá)除受病原微生物誘導(dǎo)之外，還受非生物脅迫，如傷害、寒冷、干旱、高鹽、氧化、金屬離子、紫外輻射等的誘導(dǎo)。白羽扇豆PR10蛋白在根系發(fā)育的所有階段均有組成性表達(dá)，在其他植物部位也有較小程度的表達(dá)，且存在RNAse活性[19]。此外，羽扇豆中PR10基因會(huì)受紫外輻射誘導(dǎo)[17]。在西部白松受傷害誘導(dǎo)后，PR10在基因及蛋白水平上均快速升高[20-21]。寒冬里，蘭伯氏松及西部白樺的根中PR10蛋白水平積累到最高水平[22]。同樣，冷脅迫誘導(dǎo)PR10的表達(dá)也發(fā)生在桃樹中，冬季大量積累在樹皮、木質(zhì)部中的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是儲(chǔ)存氮的載體，有助于樹木抵御或恢復(fù)非生物及生物脅迫[23]。本研究顯示，鹽脅迫能誘導(dǎo)根部的PR10基因迅速且大量地表達(dá)，說明楊樹PR10基因參與到了鹽脅迫的抗逆進(jìn)程中。楊樹PR10基因還能被茉莉酸甲酯、水楊酸誘導(dǎo)，但其對(duì)水楊酸的反應(yīng)相較于茉莉酸甲酯，表現(xiàn)更慢，2種激素誘導(dǎo)的PR10基因表達(dá)量均隨著時(shí)間增加而降低，這一點(diǎn)與在JcPR10及RSOsPR10中的研究一致[13，24]。不過，在JcPR10a研究中水楊酸與茉莉酸互為抑制反應(yīng)，這一點(diǎn)在本研究中未能展現(xiàn)[13]。

本研究中，從小黑楊中克隆出477 bp的PR10基因，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、不同植物同源蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建、亞細(xì)胞定位、時(shí)空表達(dá)分析。PR10基因在應(yīng)答高鹽、茉莉酸甲酯、水楊酸、楊樹葉枯病脅迫時(shí)具有明顯的組織特異性，且具有較高的表達(dá)。說明楊樹PR10基因參與植物滲透脅迫，與增強(qiáng)植物抗逆性有關(guān)，可以作為楊樹抗逆分子育種的備選方向。