侵染廣西紅寶石青柚的柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒遺傳進(jìn)化分析

李戰(zhàn)彪 劉麗輝 崔麗賢 陳錦清 朱英芝 李霽軒 謝慧婷 秦碧霞 蔡健和

摘要：【目的】明確引起廣西多地泰國(guó)紅寶石青柚產(chǎn)生葉片變形、扭曲、皺縮、褪綠花葉和矮化癥狀的病原，為有效防治該病害提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌膹V西多地采集疑似發(fā)病的紅寶石青柚葉片樣品，利用柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，通過分段擴(kuò)增、克隆等方法對(duì)樣品進(jìn)行鑒定并獲取全長(zhǎng)基因序列，運(yùn)用RDP5和MEGA 7.0對(duì)所獲得的全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行重組及遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】PCR檢測(cè)結(jié)果顯示采集的紅寶石青柚葉片樣品可擴(kuò)增出642 bp的目的條帶，證實(shí)紅寶石青柚受到CCDaV感染;采用分段克隆的方法獲得LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個(gè)各地代表分離物的全長(zhǎng)序列，序列長(zhǎng)度分別為3641、3642、3642、3640、3642、3644和3644 bp;核苷酸相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，7個(gè)分離物間的核苷酸相似性在98%以上，與GenBank已登錄的CCDaV各分離物間的核苷酸相似性在99%以上，說明研究獲得的病毒分離物為CCDaV的分離物;重組分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)分離物未發(fā)生重組。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，研究獲得的WZ-1和WZ-2分離物分別與Tha1-19、Tha30處于同一個(gè)小分支，說明這2個(gè)分離物與Tha1-19和Tha30具有較近的親緣關(guān)系;其余幾個(gè)分離物則分處不同的小分支，說明CCDaV廣西分離物間仍有一定的進(jìn)化多樣性?！窘Y(jié)論】引起廣西紅寶石青柚葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉和植株嚴(yán)重矮化等癥狀的病原為CCDaV，部分地區(qū)分離物存在地域多樣性。

關(guān)鍵詞： 柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒;紅寶石青柚;遺傳進(jìn)化;廣西

中圖分類號(hào)： S432.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）10-2758-07

Abstract：【Objective】To clarify the pathogen of the Ruby green pomelo showing symptoms of leaf deformation， curling， shrinking，chlorotic and dwarfing， and provide a theoretical basis for effective prevention and treatment of the disease.【Method】 Several leaf samples were collected from suspected Ruby green pomelo in some cities of Guangxi， and two pairs of specific primers of Citrus chlorotic dwarf-associated virus（CCDaV） were designed and used for detected the suspected samples， the full-length of genome sequence were obtained by segmented amplification and gene cloning. RDP5 and MEGA 7.0 softwares were applied for analyze the recombination and the genetic diversity of the full length genome. 【Result】PCR with expected size of 642 bp were obtained from all of the collected Ruby green pomelo samples， which confirmed that all of the samples were infected by CCDaV. The full-length genome sequences of seven locations representing isolates LA-1， LA-2， WM-1， GG-1， GG-2， WZ-1 and WZ-2 were obtained by using segmented amplification and gene cloning， and the full-length sequences of the seven isolates were 3641， 3642， 3642，3640， 3642， 3644 and 3644 bp， respectively. The nucleotide sequence identities between the seven isolates were over 98%， and the identities against other CCDaV isolates available in GenBank were over 99%， this results showed that the seven isolates obtained in this research were CCDaV isolates. Recombination analysis showed that no recombination occurred in the seven isolates. Phylogenetic analysis showed that two CCDaV Guangxi isolates（WZ-1 and WZ-2） clustered with Tha1-19 and Tha30 in a sub-clade， indicating their close relation. The other isolates of Guangxi were distributed in different sub-clade， indicating that there were evolutionary diversity among the CCDaV Guangxi isolates. 【Conclusion】 CCDaV is the pathogen that infects the Ruby green pomeloshowing symptoms of V shape， shrinking， curling， chlorotic and dwarfing， and there is regional diversity of the isolates among different regions.

Key words：Citrus chlorotic dwarf-associated virus; Ruby green pomelo; genetic and evolutionary; Guangxi

Foundation item：Guangxi Innovation Driven Development Special Fund Project（GuikeAA18118046-1，GuikeAA18 118046-5）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT071）

0 引言

【研究意義】近年來，我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，特別是在廣西，柑橘產(chǎn)業(yè)已成為帶動(dòng)地區(qū)脫貧、農(nóng)村就業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。但柑橘產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展也帶來了諸多問題，病蟲害的區(qū)域間發(fā)生流行已成為不可忽視的問題。隨著柑橘種植面積不斷擴(kuò)大和新品種引進(jìn)種植，區(qū)域間種苗調(diào)運(yùn)頻繁，由于難于監(jiān)管，導(dǎo)致多種病蟲害通過種苗攜帶傳播流行，并造成嚴(yán)重危害，其中，病毒病害尤其突出。本研究團(tuán)隊(duì)2019年發(fā)現(xiàn)新引種的紅寶石青柚上發(fā)生一種疑似新的病毒病害，對(duì)廣西柑橘產(chǎn)業(yè)存在潛在威脅，而明確該病害的病原可為該病害流行規(guī)律及防控技術(shù)研究提供指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘病毒病是一類嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量及質(zhì)量的重要病害。目前世界上已報(bào)道的柑橘病毒及類病毒有30余種（吳佳星，2020）;在我國(guó)，柑橘生產(chǎn)上主要的病毒有11種：柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、溫州蜜柑萎縮病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘黃脈病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）、柑橘葉斑駁病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）、柑橘樹皮裂紋類病毒（Citrus bark cracking viroid，CBCVd）、柑橘鱗皮病毒（Citrus psorosis virus，CPsV）、柑橘類病毒V（Citrus viroid V，CVdV）和柑橘類病毒VI（Citrus viroid V，CVdVI）（張艷慧等，2017）。其中，柑橘褪綠矮縮病是近年來新發(fā)生的柑橘病毒性病害，其病原是柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）。CCDaV基因組為單鏈DNA，屬于雙生病毒科（Geminiviridae），主要通過嫁接、刀割和楊梅粉虱（Parabemisia myricae Kuwana）進(jìn)行傳播;該病毒可侵染大多數(shù)的柑橘類作物，早期癥狀出現(xiàn)在春季的嫩葉上，主要癥狀特征包括葉片呈現(xiàn)V字型，同時(shí)伴隨有葉片變形、扭曲、花葉和節(jié)間變短等癥狀，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和質(zhì)量（Korkmaz et al.，1995; Richard et al.，2008; Loconsole et al.，2012）。20世紀(jì)80年代末期，該病害最早發(fā)生于土耳其的地中海區(qū)域，給土耳其柑橘產(chǎn)業(yè)造成極大危害，特別是葡萄柚，產(chǎn)量損失超過50%以上（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）。2008年，在我國(guó)云南瑞麗一個(gè)酸橙果園上首次發(fā)現(xiàn)該病害，但發(fā)病率較低，未引起廣泛關(guān)注（Guo et al.，2015）。2017年，Zhou等對(duì)該病在我國(guó)的分布進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCDaV仍只發(fā)生在我國(guó)的云南省。2020年，Yang等在泰國(guó)也發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了該病。前人的研究結(jié)果證實(shí)，柑橘褪綠矮化病正在向全世界的柑橘產(chǎn)區(qū)擴(kuò)散蔓延，應(yīng)引起重視。【本研究切入點(diǎn)】近年來，廣西柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，新品種泰國(guó)紅寶石青柚在廣西得到迅速推廣種植。2019—2020年，本研究團(tuán)隊(duì)在廣西南寧、貴港等多地柑橘育苗場(chǎng)和果場(chǎng)走訪、調(diào)查，發(fā)現(xiàn)泰國(guó)紅寶石青柚存在葉片變形、扭曲皺縮、褪綠花葉和矮化等疑似CCDaV病毒感染癥狀，發(fā)病率高達(dá)10%～15%，但引發(fā)該類癥狀的病原尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用分子生物學(xué)手段對(duì)疑似柑橘褪綠矮縮病病樣進(jìn)行檢測(cè)、鑒定，明確引發(fā)該類癥狀的病害病原，并通過分段克隆的方法獲取相關(guān)病毒病原的全序列基因組，運(yùn)用RDP和MEGA等軟件分析該病毒病原的來源和進(jìn)化規(guī)律，為紅寶石青柚上柑橘褪綠矮縮病的防控打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

2019年11月—2020年11月，分別從廣西梧州市藤縣太平鎮(zhèn)（東經(jīng)23°39′14″，北緯110°42′37″）（6個(gè)葉片樣品）、南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)浪灣農(nóng)場(chǎng)（東經(jīng)23°05′06″，北緯107°54′19″）（10個(gè)葉片樣品）、貴港市覃塘區(qū)大嶺鎮(zhèn)（東經(jīng)22°53′38"，北緯109°32′45″）（4個(gè)葉片樣品）和港南區(qū)木格鎮(zhèn)（東經(jīng)22°47′45″，北緯109°44′）（5個(gè)葉片樣品）、南寧市武鳴區(qū)府城鎮(zhèn)（東經(jīng)23°15′06″，北緯108°07′57″）（10個(gè)葉片樣品）和太平鎮(zhèn)（東經(jīng)23°08′02″，北緯108°22′34″（6個(gè)葉片樣品）等地采集疑似感染CCDaV的紅寶石青柚葉片樣品，葉片樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 DNA提取

取柚子葉片樣品100 mg，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取葉片總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。最后將DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 PCR檢測(cè)

參考NCBI中已登錄的CCDaV全基因序列（登錄號(hào)NC_018151、MN509442.1、MG566055.1和KX840470.1等），設(shè)計(jì)可擴(kuò)增CCDaV部分基因序列的特異PCR引物，CCDaV-F：5'-GGACAATATGGG ACAAGCCGTG-3'/CCDaV-R：5'-GGATCGTATGG GCCACAGACC-3'，目的條帶大小約為642 bp;以健康柚子葉片總DNA為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 μL：總DNA 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix （Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）10.0 μL，ddH2O 8.0 μL。菌落PCR反應(yīng)體系10.0 μL：10 μmol/L上、下游引物CCDaV-F/CCDaV-1047R（CCDaV-1047R：5'-AACACAAATC TAACGGCCTCAGG-3'）或CCDaV-1047F（CCDaV-1047F：5'-CAGTGCGTGGTCGTTGTAGTCG-3'）/CCDaV-R各0.5 μL，2×Taq Master Mix （Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）5.0 μL，ddH2O 4.0 μL，滅菌牙簽挑取菌落作為模板溶解于PCR反應(yīng)體系中。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s或72 ℃ 3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 4 全基因序列擴(kuò)增

以PCR檢測(cè)為陽性的柚子葉片總DNA為模板，利用CCDaV-F/CCDaV-1047R或CCDaV-1047F/CC DaV-R分段擴(kuò)增CCDaV各分離物的全基因序列，反應(yīng)體系20.0 μL：總DNA 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10.0 μL，ddH2O 8.0 μL。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行切膠純化。

1. 5 基因克隆及序列分析

利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收PCR產(chǎn)物，將經(jīng)回收純化的PCR產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt Cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）中的克隆載體上;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用菌落PCR的方法篩選3個(gè)陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。所得序列經(jīng)Vector NTI 11.0進(jìn)行拼接后，使用NCBI的ORF Finder程序進(jìn)行開放讀碼框（Open reading frames，ORF）預(yù)測(cè);利用MEGA 7.0的最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，步值設(shè)置為1000;利用RDP5中的RDP、GENECONV、Chimaera和MaxChi進(jìn)行重組分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 泰國(guó)紅寶石青柚病樣癥狀及PCR檢測(cè)結(jié)果

2019—2020年，本課題組在廣西南寧、貴港等多地柑橘育苗場(chǎng)和果場(chǎng)走訪、調(diào)查，發(fā)現(xiàn)泰國(guó)紅寶石青柚的葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉、植株嚴(yán)重矮化等，疑似CCDaV病毒感染癥狀（圖1），發(fā)病率高達(dá)10%～15%。采集疑似病毒感染的柚子葉片樣品，利用柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒特異引物CCDaV-F/CCDaV-R對(duì)青柚葉片總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西梧州市藤縣（6個(gè)葉片樣品）、南寧市隆安縣（10個(gè)葉片樣品）、貴港市（8個(gè)葉片樣品）、南寧市武鳴區(qū)府城鎮(zhèn)（10個(gè)葉片樣品）和太平鎮(zhèn)（4個(gè)葉片樣品）等地的柚子葉片樣品均可擴(kuò)增出642 bp的目的條帶（部分檢測(cè)結(jié)果見圖2），而健康柚子葉片對(duì)照則無相應(yīng)擴(kuò)增;將PCR產(chǎn)物回收純化后直接測(cè)序，所得序列在NCBI中進(jìn)行BLASTn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究所得序列與NCBI已報(bào)道的CCDaV各分離物序列核苷酸相似性均在99%以上，說明所采集的青柚葉片感染了CCDaV病毒。

2. 2 病毒分離物基因組全序列克隆及分析結(jié)果

前期嘗試?yán)肦CA試劑盒擴(kuò)增病毒的全序列，但常用的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后電泳均得不到目的片段為3.6 kb的電泳條帶，遂采用分段擴(kuò)增的方法對(duì)所采集的柚子葉片總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以期能獲得CCDaV各分離物的全基因序列。挑選7個(gè)有代表性的柚子DNA利用CCDaV-F/CCDaV-1047R和CCDaV-1047F/CCDaV-R兩對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收純化后連接至pEASY-Blunt Cloning Kit中的克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。所得序列經(jīng)拼接比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，共獲得LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個(gè)各地代表分離物的全長(zhǎng)序列分別為3641、3642、3642、3640、3642、3644和3644 bp（GenBank登錄號(hào)分別為：MW413549、MW413550、MW413551、MW413552、MW413553、MW413554和MW413555），兩兩序列間的核苷酸相似性均在98%以上，可認(rèn)定為同一病毒的不同分離物。

進(jìn)一步分析7個(gè)分離物的分子特征，發(fā)現(xiàn)7個(gè)分離物中的3個(gè)分離物（LA-1、LA-2和WM-1）編碼5個(gè)ORF，而其余4個(gè)分離物則編碼4個(gè)ORF。其中LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7個(gè)分離物正鏈均編碼V2蛋白[運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein，MP），LA-1：195～614 nt、LA-2：195～614 nt、WM-1：194～613 nt、GG-1：195～614 nt、GG-2：195～614 nt、WZ-1：195～614 nt和WZ-2：197～616 nt]、V1蛋白[外殼蛋白（Coat protein，CP），LA-1：418～1182 nt、LA-2：418～1182 nt、WM-1：417～1181 nt、GG-1：418～1182 nt、GG-2：418～1182 nt、WZ-1：418～1182 nt和WZ-2：420～1184 nt]和V3蛋白（運(yùn)動(dòng)蛋白，LA-1：1212～2132 nt、LA-2：1213～2133 nt、WM-1：1213～2133 nt、GG-1：1213～2133 nt、GG-2：1213～2133 nt、WZ-1：1214～2134 nt和WZ-2：1215～2135 nt），互補(bǔ)鏈均編碼類Rep蛋白[（RepA-like protein），LA-1：2612～3421 nt、LA-2：2613～3422 nt、WM-1：2613～3422 nt、GG-1：2611～3420 nt、GG-2：2613～3422 nt、WZ-1：2614～3423 nt和WZ-2：2615～3424 nt];LA-1、LA-2和WM-1的互補(bǔ)鏈編碼1個(gè)類C1：C2蛋白[（C1：C2 like protein），LA-1：2301～2708 nt、LA-2：2302～2709 nt、WM-1：2302～2709 nt]，而GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2在其相應(yīng)編碼區(qū)域存在多個(gè)終止密碼子，無法形成完整的ORF。

將本研究獲得的基因序列利用NCBI中BLASTn工具與GenBank已報(bào)道的病毒序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)廣西的7個(gè)分離物與GenBank中已報(bào)道的各CCDaV分離物序列具有較高的核苷酸相似性。進(jìn)一步利用SDT軟件進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)廣西分離物的核苷酸序列與用于分析的各CCDaV分離物的核苷酸相似性均在99%以上（圖3）。

2. 3 CCDaV廣西分離物的重組及進(jìn)化分析結(jié)果

為分析CCDaV是否存在重組，挑選TK4和CN001作為參考基因序列利用RDP5中的RDP、GENECONV、Chimaera和MaxChi進(jìn)行重組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCDaV尚未有重組事件發(fā)生。

為分析CCDaV廣西分離物與已報(bào)道的CCDaV各分離物的親緣關(guān)系，利用MEGA 7.0將廣西分離物與12個(gè)CCDaV分離物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，最大似然法構(gòu)建的進(jìn)化樹為最優(yōu)樹（圖4）。從圖中可看出，廣西各分離物處于不同的分支，其中WZ-2與泰國(guó)分離物Tha30處于同一分支，說明其與Tha30親緣關(guān)系較近;WZ-1、GG-1、GG-2和Tha1-19同處于一個(gè)大分支，說明與Tha1-19親緣關(guān)系較近，而WZ-1與泰國(guó)分離物Tha1-19又處于一個(gè)小分支，說明WZ-1與Tha1-19的親緣關(guān)系更近;LA-2與WM-1處于同一分支，說明二者間親緣關(guān)系較近;而LA-1則獨(dú)立處于一個(gè)小分支，進(jìn)化來源可能與其他分離物存在差異，說明CCDaV廣西分離物間仍有一定的進(jìn)化多樣性。

3 討論

柑橘褪綠矮縮病是一種危險(xiǎn)性柑橘病毒病害，已給土耳其柑橘產(chǎn)業(yè)帶來極大危害，且可能對(duì)全世界柑橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生潛在威脅（Kersting et al.，1996; Richard et al.，2008）。在我國(guó)，該病害最早于2008年在云南瑞麗被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，但多年間并未擴(kuò)展蔓延。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得侵染廣西紅寶石青柚的病毒基因組序列，通過分析其分子特征及進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)廣西分離物具有CCDaV病毒基因組的典型分子特征，且與其他已報(bào)道的CCDaV分離物的核苷酸相似性均在99%以上，可認(rèn)定為CCDaV的分離物（Loconsole et al.，2012）。研究也發(fā)現(xiàn)，廣西分離物進(jìn)化較保守，且存在一定的地域分布特征，與Karanfil和Korkmaz（2019）、Yang等（2020）的研究結(jié)果一致。調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西區(qū)內(nèi)的紅寶石青柚均為泰國(guó)引種，而廣西分離物呈現(xiàn)的地域分布特征可能與引種地不同相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探究。

Loconsole等（2012）通過小RNA測(cè)序證實(shí)CCDaV是單鏈DNA病毒，并且認(rèn)為其編碼5個(gè)ORF。而本研究中GG-1和GG-2在2302～2708 nt，WZ-1、WZ-2在2303～2709 nt和2304～2710 nt區(qū)域則存在多個(gè)終止密碼子，無法形成完整的ORF。通過將上述序列與GenBank已登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這些序列在該區(qū)域的相似性高達(dá)99%以上（數(shù)據(jù)未顯示），且均存在多個(gè)終止密碼子，因此，該區(qū)域是否編碼完整的ORF仍有待進(jìn)一步證實(shí)。如果該區(qū)域無法完整編碼ORF，那么CCDaV是否仍然是雙生病毒科成員也是一個(gè)需要探討的科學(xué)問題，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

柑橘褪綠矮縮病是一種較新的柑橘病毒病害，各方面研究仍不完善，前人研究表明該病可借助嫁接、刀割以及楊梅粉虱通過半持久或持久方式進(jìn)行傳播（Korkmaz et al.，1995），但Zhou等（2017）、Karanfil和Korkmaz（2019）分別就CCDaV在我國(guó)及土耳其的分布進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害并未廣泛傳播;不同的是，楊梅粉虱在云南的種群較龐大，而在土耳其的種群較小，但無論種群大小，該病的傳播流行并未呈現(xiàn)明顯差別（劉曼等，2010;Zhou et al.，2017;Karanfil and Korkmaz，2019）。同時(shí)，Zhou等（2017）采集云南的楊梅粉虱進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)楊梅粉虱體內(nèi)并未攜帶CCDaV，因此，楊梅粉虱是否能夠傳播CCDaV，其傳播CCDaV的效率仍有待進(jìn)一步研究，而是否存在其他潛在的傳播介體也需要進(jìn)一步研究證實(shí)。在我國(guó)江西、廣東、浙江、四川和上海等地的柑橘產(chǎn)區(qū)均有楊梅粉虱分布（王向東和羅林軍，2007;王炎，2007;沈穎等，2017;閆鳳鳴和白潤(rùn)娥，2017），廣西尚未有楊梅粉虱的相關(guān)報(bào)道;根據(jù)前期調(diào)查研究及分析推測(cè)，該病極有可能通過泰國(guó)紅寶石青柚帶病苗木在廣西等地?cái)U(kuò)散蔓延，而廣西是否存在楊梅粉虱、CCDaV是否會(huì)通過楊梅粉虱傳播危害其他柚類等柑橘品種、是否存在其他潛在的傳播介體幫助CCDaV在廣西傳播流行、是否對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失等問題都值得進(jìn)一步關(guān)注及監(jiān)測(cè)研究。

柑橘褪綠矮縮病危害較大，可侵染多數(shù)的柑橘類作物，僅甜橙具有一定抗性（Korkmaz et al.，1995），給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來極大的潛在威脅，因此，針對(duì)目前該病的防控，建議抓好如下幾點(diǎn)：（1）嚴(yán)格苗木檢測(cè)，培育健康苗木，嚴(yán)禁帶病種苗出圃;（2）加強(qiáng)苗木調(diào)運(yùn)檢疫監(jiān)管，防止帶病苗木調(diào)運(yùn);（3）及時(shí)防治傳播介體楊梅粉虱，切斷傳播途徑。

4 結(jié)論

侵染廣西紅寶石青柚引起葉片呈V字型、皺縮、卷曲、褪綠花葉和植株嚴(yán)重矮化等癥狀的病原為柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒;通過分析部分分離物的全基因序列，發(fā)現(xiàn)CCDaV廣西分離物進(jìn)化相對(duì)保守，但仍存在一定的地域多樣性。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）