發(fā)展親和質(zhì)譜技術(shù)加速G蛋白偶聯(lián)受體的配體篩選和藥物發(fā)現(xiàn)

張冰潔，水雯箐?

①上?？萍即髮W(xué) iHuman研究所，上海 201210；② 上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor,GPCR）是人體中最大的一類膜蛋白受體家族，參與調(diào)控多種重要的生理和病理過程，因而也是一類極為重要的藥物靶標。據(jù)統(tǒng)計，超過30%的上市藥物通過靶向特定的GPCR發(fā)揮治療作用[1]。因此，各大制藥企業(yè)和科研單位都在不遺余力地篩選、設(shè)計靶向特定GPCR的新型配體，以期獲得高效價、高選擇性的藥物先導(dǎo)化合物。

目前，以GPCR為靶標蛋白進行配體篩選的方法多種多樣，各種技術(shù)依據(jù)其特點應(yīng)用于藥物先導(dǎo)化合物早期發(fā)現(xiàn)流程中的各個階段。根據(jù)技術(shù)原理和檢測方式的差異，通過濕實驗進行GPCR配體篩選的方法主要分為以下三類：基于受體-配體親和作用（affinity/binding-based）的篩選方法、基于蛋白熱穩(wěn)定性（stability-based）的篩選方法以及基于細胞信號通路活性檢測（cell signaling-based）的篩選方法?；谑荏w-配體親和作用的篩選方法可檢測GPCR靶蛋白與化合物的直接相互作用，并定量親和力的高低。其中DNA編碼化合物庫（DNA encoded library,DEL）篩選技術(shù)因其龐大的篩選規(guī)模（數(shù)十億化合物）和高效的檢測手段（高通量測序）成為當(dāng)前新藥發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域最前沿的技術(shù)之一[2-5]，而且已經(jīng)成功應(yīng)用于GPCR的配體篩選和發(fā)現(xiàn)[6-8]。然而需要指出的是，DEL技術(shù)通常需要對化合物進行DNA偶聯(lián)反應(yīng)，該步驟可能影響或破壞化合物與受體的天然相互作用。親和質(zhì)譜技術(shù)是另一種迅速發(fā)展、得到廣泛關(guān)注的GPCR配體篩選方法[9-14]，同樣基于對受體-配體結(jié)合的檢測。研究表明，該技術(shù)能夠在進行高通量篩選的同時半定量地評估多個配體對于同一靶標的相對親和力[12,15]。

基于細胞信號通路活性檢測的篩選方法，主要通過檢測由GPCR蛋白介導(dǎo)的特定信號通路中的下游效應(yīng)分子（如cAMP、Ca2+、IP1/IP3等）反映出配體對受體功能的調(diào)控作用。基于蛋白熱穩(wěn)定的篩選方法，通常需要獲得體外純化的靶蛋白，加入待測配體，描繪蛋白的熔解溫度曲線，進而評價配體對靶蛋白熱穩(wěn)定性的影響。表1總結(jié)了這三大類實驗篩選方法中各種常用技術(shù)可測量的相互作用參數(shù)和分析通量?；谟H和作用的篩選技術(shù)與基于細胞信號通路活性檢測的篩選技術(shù)具有高度互補性，因此在早期先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)過程中，將多種技術(shù)聯(lián)合用于靶向GPCR的配體篩選能極大程度地降低假陽性和假陰性率，提高藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)幾率[15]。本文主要介紹親和質(zhì)譜技術(shù)用于GPCR配體篩選的基本原理及其特點，并詳細總結(jié)該技術(shù)用于大規(guī)?；衔飵旒疤烊徊荼敬痔嵛锖Y選的前沿進展。

表1 應(yīng)用于GPCR靶向的配體篩選的各種實驗技術(shù)

1 親和質(zhì)譜篩選技術(shù)

現(xiàn)代生物質(zhì)譜由于其高靈敏度、高特異性和快速的分析速度，已經(jīng)發(fā)展成為探究蛋白質(zhì)與各種配體（小分子化合物、小肽、核酸或金屬離子）以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵技術(shù)（表1）?；谫|(zhì)譜的親和作用篩選技術(shù)在以可溶性蛋白為靶標的配體篩選中得到了廣泛應(yīng)用[9-14]，而近期也成功拓展到更具挑戰(zhàn)的以GPCR為靶標的配體發(fā)現(xiàn)中。基于質(zhì)譜的親和作用分析方法主要分為兩大類：一類是檢測溶液中結(jié)合于靶蛋白上配體的親和質(zhì)譜技術(shù)（affinity MS），具體包括自動化配體篩選系統(tǒng)、超濾親和質(zhì)譜技術(shù)、前沿親和色譜-質(zhì)譜技術(shù)、基于細胞膜的親和質(zhì)譜篩選技術(shù)和競爭性結(jié)合質(zhì)譜檢測[16-21]；另一類是在氣相中檢測蛋白-配體復(fù)合物的非變性質(zhì)譜技術(shù)（native MS）[22-23]。

與其他藥物早期發(fā)現(xiàn)流程中的配體檢測主流技術(shù)相比，親和質(zhì)譜篩選技術(shù)具有以下獨特的優(yōu)勢：①無偏向性，可同時篩選正構(gòu)和別構(gòu)作用配體；②可分析高度復(fù)雜的配體混合物，確認配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)；③一般無需標記配體和靶蛋白，維持蛋白-配體復(fù)合物的天然構(gòu)象；④定量準確，能夠評估配體的親和力大?。虎莅械鞍紫牧康?；⑥方法普適性高，適用于不同類型的靶蛋白。以下逐一介紹特定的親和質(zhì)譜技術(shù)在GPCR配體篩選和藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用實例。

1.1 自動化配體篩選系統(tǒng)

自動化配體篩選系統(tǒng)（automated ligand identification system, ALIS）是目前制藥企業(yè)開展大規(guī)模合成化合物庫高通量配體篩選時最為廣泛采用的技術(shù)之一[9,12,24-27]。該系統(tǒng)通過分子排阻色譜將靶蛋白-配體復(fù)合物與游離配體進行分離，然后靶蛋白-配體復(fù)合物在反相色譜中解離，從靶蛋白上釋放的配體進入高分辨質(zhì)譜中進行定性和定量分析。ALIS在可溶性蛋白的配體篩選中得到了廣泛應(yīng)用，但是由于GPCR這類膜蛋白難以獲得大量穩(wěn)定的純化蛋白，因此該項技術(shù)用于GPCR配體篩選的報道較為少見。最早將ALIS用于GPCR配體篩選工作的是Whitehurst等人[21]將其用于毒蕈堿類乙酰膽堿受體（muscarinic M2 acetylcholine receptor, mAChR）的配體發(fā)現(xiàn)。他們將純化的豬源M2蛋白與1 500個化合物組成的混合物為一個單元進行親和篩選，在對35萬個成員組成的化合物庫完成篩選后，發(fā)現(xiàn)了2個mAChR的配體，包括1個拮抗劑和1個別構(gòu)調(diào)節(jié)劑。隨后，另一個研究團隊采用類似的篩選策略開展了對人源趨化因子受體CXCR4的配體篩選研究[21]。值得一提的是，Whitehurst等人將250 ng純化的蛋白與100或2 000個化合物進行孵育，按照該反應(yīng)條件，完成了對4.8萬和275萬個化合物組成的超大化合物庫的篩選工作。最終，他們從中共發(fā)現(xiàn)了362個潛在配體，進一步的研究表明其中34個化合物是CXCR4的新型拮抗劑[21]。

1.2 基于細胞膜和純化蛋白的親和質(zhì)譜篩選

雖然ALIS已經(jīng)成功應(yīng)用于GPCR的配體篩選中，但是將該技術(shù)拓展于其他的GPCR靶標蛋白仍然存在巨大挑戰(zhàn)。這主要是因為GPCR是一類七次跨膜螺旋的膜蛋白，其天然活性形式穩(wěn)定性差，表達量低，通常需要花費大量的時間、精力來優(yōu)化GPCR蛋白的重組表達和純化條件[21]。為了突破這一局限，我們課題組建立了基于細胞膜的親和質(zhì)譜篩選技術(shù)，用于靶向GPCR蛋白的配體篩選[19]。該方法以高表達特定野生型GPCR的細胞膜組分為篩選對象，與小分子混合物進行孵育，收集細胞膜上富集的配體，然后通過高分辨質(zhì)譜進行定性和定量分析（圖1（a）），同時根據(jù)化合物結(jié)合指數(shù)BI區(qū)分強結(jié)合、弱結(jié)合與非特異性結(jié)合（圖1（b））。我們以480個化合物組成的混合物為一組進行篩選，每組需要約 2 μg處于細胞膜上的GPCR蛋白。通過對一個4 333個小分子組成的化合物庫進行篩選，我們成功發(fā)現(xiàn)了1個靶向五羥色胺2C受體（5-HT2CR）的新型拮抗劑與4個靶向胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R）的新型正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑（圖1（c））。該新技術(shù)的最大特點是省去了膜蛋白的純化步驟，使得GPCR蛋白處于天然細胞膜環(huán)境中，最大程度維持其天然活性構(gòu)象。

為了進一步提高篩選效率，我們發(fā)展了一項新型的多輪富集親和質(zhì)譜篩選技術(shù)，該方法能夠一次性從2萬個小分子組成的混合物中快速篩選出靶向GPCR的高親和力配體，極大減少了篩選所需的實驗成本和儀器機時。我們以A2A腺苷受體（A2AR）為靶標蛋白，分別對 480個、2 400個、4 800個和2萬個成員組成一個混合物進行配體篩選，結(jié)果顯示A2A受體的16個陽性小分子中具有較高親和力的配體（Kd或Ki＜ 5 μmol/L），無論常規(guī)通量（480個）或是提高通量（2 400個、4 800個、2萬個）都能被篩選出。同時，該方法不僅適用于純化的GPCR蛋白，也適用于表達GPCR蛋白的細胞膜組分的配體篩選。利用該方法，我們成功發(fā)現(xiàn)了3個靶向A2AR蛋白的新型拮抗劑。目前單次實驗的篩選通量是每組2萬個化合物，如果進一步提高對化合物庫富集的效率，我們預(yù)期該技術(shù)可以達到一次性篩選十萬個甚至百萬個混合物的篩選通量，逐漸接近DEL的篩選水平[28]。

圖1 基于細胞膜的親和質(zhì)譜技術(shù)篩選靶向GPCR的新型小分子調(diào)節(jié)劑。（a）親和質(zhì)譜篩選流程。（b）基于細胞膜的親和質(zhì)譜篩選靶向GLP-1R小分子配體結(jié)果。化合物庫由4 333個成員組成，分為9個混合物分別進行篩選。紅色圓點表示篩選發(fā)現(xiàn)的潛在配體，灰色圓點表示未結(jié)合的化合物。（c）親和質(zhì)譜篩選發(fā)現(xiàn)的5-HT2CR（上）與GLP-1R（下）新型小分子調(diào)節(jié)劑在放射性同位素標記實驗中得到進一步驗證

近年來，親和質(zhì)譜技術(shù)因其能夠快速從天然產(chǎn)物粗提物中富集并鑒定到針對特定蛋白靶標的小分子配體，從而在以代謝酶為代表的可溶性蛋白的配體篩選中得到了廣泛應(yīng)用，明顯提高了天然草藥中有效活性組分的發(fā)現(xiàn)幾率[29-34]。我們課題組首次拓展親和質(zhì)譜篩選技術(shù)用于從天然產(chǎn)物粗提取中篩選靶向GPCR的新結(jié)構(gòu)、新活性配體。我們首先對多種中藥提取物進行了5-HT2C受體的細胞活性評價，然后針對活性較好的中藥提取物開展親和質(zhì)譜篩選。同時，我們將親和質(zhì)譜與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，使得復(fù)雜的中藥提取物中各組分化合物的結(jié)構(gòu)鑒定更為靈敏和準確（圖2（a））。通過該方法，我們快速從中藥提取物中發(fā)現(xiàn)了靶向5-HT2C受體的新型選擇性激動劑巴婆堿（asimilobine）。隨后的藥理學(xué)研究顯示，該化合物能夠特異性激活5-HT2C受體，而對同源性很高的五羥色胺2A受體（5-HT2AR）和2B（5-HT2BR）沒有激動活性（圖2（b～d））。同時，它能偏向性地激活Gq蛋白下游信號通路而不影響β-arrestin招募通路，并且在急性和慢性實驗動物模型上發(fā)現(xiàn)巴婆堿通過抑制小鼠進食來降低體重。該研究提供了一種高效的研究手段，有助于從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)靶向GPCR的新結(jié)構(gòu)、新活性配體[35]。

盡管未直接應(yīng)用于GPCR蛋白，但是基于全細胞的針對血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）配體篩選的報道值得我們關(guān)注，并且該方法有望應(yīng)用于GPCR的配體發(fā)現(xiàn)[36]。作者針對過表達VEGFR2的細胞構(gòu)建了一種特殊的“一珠一化合物”的多肽樣品庫，熒光顯微鏡下選擇與被標記的VEGFR2細胞結(jié)合的珠子，并用串聯(lián)質(zhì)譜分析對所附配體進行解碼。該研究中發(fā)現(xiàn)的活性最好的配體對可溶性VEGFR2胞外結(jié)構(gòu)域具有低微摩爾級的親和力。

圖2 （a）親和質(zhì)譜篩選流程；（b）結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)從分段后的中藥提取物中篩選到的潛在配體（加大的粉色圓點表示阿樸菲類生物堿；BI表示化合物結(jié)合指數(shù)）；（c）通過MS/MS譜圖進一步確認化合物1857的結(jié)構(gòu)；（d）1857選擇性激動5-HT2C受體

1.3 競爭性結(jié)合質(zhì)譜檢測

競爭性結(jié)合質(zhì)譜檢測最初由Wanner研究組開發(fā)，使用非放射性同位素標記的示蹤配體與待測試化合物進行競爭，這與放射性同位素標記的配體結(jié)合實驗的原理相似，但是該方法避免使用放射性同位素試劑，提高了實驗的可操作性和安全性[37-39]。該實驗中，將示蹤配體從靶蛋白上解離釋放，采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring, MRM）技術(shù)對其進行定性和定量分析，提高了化合物檢測的靈敏度和特異性。值得一提的是，該方法的研究對象是過表達目標蛋白的細胞膜組分，可用于膜受體與配體結(jié)合作用的生化表征。

目前，競爭性結(jié)合質(zhì)譜分析不僅成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)運蛋白（transporter）和離子通道（ion channel）的配體表征中，而且在GPCR蛋白上也同樣得到應(yīng)用。例如，最近腺苷受體A1/A2A和多巴胺受體D1/D2/D5與其配體相互作用均通過該方法進行表征[18,38,40-41]。研究者證明了該方法能夠用于飽和、置換、解離與競爭相關(guān)的各項配體表征實驗中，而且通過放射性同位素標記結(jié)合實驗與競爭性結(jié)合質(zhì)譜實驗得到的用于表征受體-配體結(jié)合作用的主要參數(shù)非常吻合[18,40]。目前，該方法主要用于表征特定化合物的結(jié)合屬性，或者在相對較低的通量下對專屬性化合物庫進行配體篩選。

2 展望

基于受體-配體親和作用的篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的基于細胞信號通路活性檢測的高通量篩選技術(shù)高度互補，已發(fā)展成為藥物早期發(fā)現(xiàn)流程中的關(guān)鍵性技術(shù)。親和質(zhì)譜篩選技術(shù)為靶向GPCR蛋白的配體發(fā)現(xiàn)研究提供了一種高通量、無偏向性、靈活便捷的篩選手段，尤其適用于功能不明確、缺乏細胞活性檢測手段的靶標，例如對孤兒受體進行內(nèi)源性配體的鑒定或工具性化合物的開發(fā)。同時，將親和質(zhì)譜篩選與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，有望從復(fù)雜的天然產(chǎn)物庫或組織、細胞代謝物組中高效發(fā)現(xiàn)靶向GPCR蛋白的新結(jié)構(gòu)、新活性配體。我們相信，將親和質(zhì)譜篩選技術(shù)與組學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)和GPCR分子藥理學(xué)手段結(jié)合，將加速靶向GPCR的高選擇性、高效價的工具化合物開發(fā)與新藥發(fā)現(xiàn)。