鴿源鼠傷寒沙門氏菌的分離鑒定

亓玉卓,梁 琳，林偉東，劉 琪，2，梁瑞英，賈亞雄，張 莉，崔尚金*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100193；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；4.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的一種人畜共患病，10月齡內(nèi)的鴿對(duì)其易感，鴿飛行能力也受其影響，該菌可通過(guò)損傷的皮膚、眼結(jié)膜、呼吸道及消化道傳播，部分沙門氏菌也可通過(guò)鴿卵垂直傳播[1]。沙門氏菌血清型分屬35個(gè)群或亞群，感染禽類的沙門氏菌有38種，分屬7個(gè)O群(O4、O7、O8、O9、O10、O11、O19)[2-3]。鴿沙門氏菌病主要由鼠傷寒型沙門氏菌引起，又稱鴿副傷寒，傳播方式主要是水平傳播[4]，乳鴿的哺育通過(guò)母鴿經(jīng)口腔喂食，鼠傷寒沙門氏菌可以在喂食過(guò)程中，從帶菌母鴿經(jīng)口腔直接傳播給乳鴿；同時(shí)其排泄物也可成為傳播源。污染的禽、肉等產(chǎn)品，也是沙門氏菌污染的一個(gè)來(lái)源。2003年，Capita R等[5]的調(diào)查結(jié)果顯示，西班牙49%的雞肉中含有沙門氏菌，污染率較高。2005年，國(guó)內(nèi)也有報(bào)道深圳市售肉品中有26.2%也受到了沙門氏菌污染[6]。2008年，對(duì)蘭州市肉與肉制品微生物污染狀況調(diào)查結(jié)果顯示，7.5%生豬胴體中可檢出沙門氏菌[7]。2018年，在泰國(guó)肉雞和豬中的感染率分別為18.05%和37.54%[8]。2019年，謝冠東[9]對(duì)北京市售鴿肉中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定,檢出率達(dá)21%?？梢?jiàn)，沙門氏菌的污染情況十分普遍。隨著養(yǎng)鴿業(yè)的發(fā)展，沙門氏菌將會(huì)擁有更多的傳播途徑，對(duì)食品衛(wèi)生安全和人類健康存在潛在威脅[10]。因此，鴿場(chǎng)的沙門氏菌流行情況對(duì)公共衛(wèi)生安全已經(jīng)十分必要。

本試驗(yàn)從北京郊區(qū)某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)疑似鴿副傷寒瀕死的10日齡乳鴿各臟器中進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定，分別采用16S rRNA基因測(cè)序、革蘭氏染色、培養(yǎng)特性觀察和生化試驗(yàn)，判定該菌為鼠傷寒沙門氏菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)分析了其耐藥性，以期為鴿場(chǎng)在疾病預(yù)防和用藥方面提供理論參考[11]。動(dòng)物回歸試驗(yàn)，無(wú)論通過(guò)口服、肌注、靜脈注射的攻毒方式都能使試驗(yàn)鴿死亡，用分離菌可復(fù)制得到原有特征性剖檢病變，確定了該菌為此養(yǎng)鴿場(chǎng)的致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 北京某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生乳鴿肛門周圍黃綠色糞污，肝臟腫大，并造成死亡，疑似沙門氏菌感染，從該鴿場(chǎng)采集瀕死10 日齡乳鴿1只；試驗(yàn)用健康鴿，購(gòu)自北京市某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)特定病原檢測(cè)后確定為不帶病健康鴿。瀕死乳鴿在超凈工作臺(tái)內(nèi)使用高壓滅菌的器械剖檢，無(wú)菌采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌于平皿，切下大約1 cm3大小的組織塊置于15 mL 離心管內(nèi)，加等體積PBS，使用手持電動(dòng)研磨器對(duì)組織進(jìn)行充分研磨，并采集病變明顯的臟器制作成石蠟切片，記錄病理變化。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 無(wú)菌脫纖維綿羊血，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；麥康凱培養(yǎng)基、沙門氏菌選擇性分離培養(yǎng)基XLD瓊脂、沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基SS瓊脂、沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基HE瓊脂、MH瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；2×La-Master Mix，南京諾唯贊有限公司；DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀，北京君意電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DHP9052B)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng) 將無(wú)菌操作取得的病鴿內(nèi)臟研磨后接種到血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，然后觀察菌落，根據(jù)其顏色、形態(tài)、溶血性、數(shù)目(菌落數(shù)目小于3的舍棄)，記錄并選取各個(gè)不同類型菌落純化、革蘭氏染色和鏡檢[12]。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1.2.2.1 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng) 將革蘭氏陰性桿狀的可疑致病菌首先接種于XLD瓊脂、SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2.2 生化試驗(yàn) 將純化后的該株分離菌分別接種于生化鑒定管中[13](葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、黏酸鹽、蔗糖、乳糖、水楊酸、棉子糖、半固體、MR、H2S、檸檬酸鹽、尿素酶、V-P、吲哚)，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.2.3 16S rRNA PCR擴(kuò)增 采用天根試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，選用16S的通用引物，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。引物序列如下：上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。引物由GENEWIZ生物科技有限公司合成。細(xì)菌DNA 2 μL作為模板，擴(kuò)增體系50 μL: 16S上、下游通用引物各2 μL，2×La-Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 10 min;94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將純化后的PCR產(chǎn)物送英濰捷基公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中以Blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)，從中選取相似性較高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 6.0中Kimura-2參數(shù)矩陣的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2.4 血清學(xué)鑒定 將疑似沙門氏菌的分離株，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2016中的要求鑒定該疑似菌株的血清型[14]。首先用A～F多價(jià)O血清進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)生理鹽水作為對(duì)照，陽(yáng)性凝集的再分別用其余的O單因子的各個(gè)血清分別進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)此即可判定分離菌O抗原型。以Vi血清鑒定其Vi抗原，然后以H復(fù)合血清及H單因子血清鑒定其鞭毛抗原，參照說(shuō)明書(shū)中沙門氏菌屬抗原診斷表，根據(jù)其菌性特征，做出診斷。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)( NCCLS-2018) 描述的K-B法的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行判定，檢測(cè)分離菌株的耐藥譜。檢測(cè)的藥敏紙片包含氨芐西林(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、美羅培南(20 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、阿米卡星(30 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判定耐藥表型。

1.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 分離菌株培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)后進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)。將10日齡乳鴿進(jìn)行隨機(jī)分組，每組3只。培養(yǎng)新鮮已鑒定的病菌，分別以口服、肌注、靜脈注射的方式進(jìn)行攻毒(攻毒劑量108CFU/只)，每只0.2 mL。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，以生理鹽水代替菌液，每只0.2 mL。對(duì)病死鴿進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離。觀察并記錄剖檢結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理剖檢

病鴿呈現(xiàn)精神萎靡不振、食欲下降、瘦弱的現(xiàn)象，乳鴿腹部發(fā)黑。剖檢結(jié)果顯示肝臟腫大較嚴(yán)重，呈暗紅色，質(zhì)地變脆，一觸即破，邊緣有壞死(圖1A)；腎臟腫大，腸道發(fā)現(xiàn)有條狀出血，脾臟腫大；胸腔有黃色纖維素性滲出(圖 1B)。病理切片結(jié)果顯示，肺臟主要表現(xiàn)為嚴(yán)重出血，血管擴(kuò)張，肺內(nèi)見(jiàn)大量粉紅色滲出(圖2A)；肝臟表現(xiàn)為炎癥，主要集中在中央靜脈周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B)。

2.2 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察

該分離菌株在血平板上均呈現(xiàn)白色、濕潤(rùn)、中等大小的菌落。在XLD瓊脂上呈現(xiàn)粉紅色透明菌落，中間有黑色中心(圖3A)。在HE瓊脂上呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，中間有褐色中心(圖3B)。SS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均為無(wú)色半透明，菌落中心帶有黑色(圖3C)。在麥康凱培養(yǎng)基上均為圓形半透明灰白色菌落(圖3D)。

A.肝臟腫大，質(zhì)地變脆；B.胸腔有纖維素性滲出

A.肺臟出血；B中央靜脈周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

2.3 革蘭氏染色鏡檢

經(jīng)革蘭氏染色，油鏡下觀察到該菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌(圖4)。

2.4 生化與血清學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 生化鑒定結(jié)果 該分離株細(xì)菌可發(fā)酵葡萄糖(產(chǎn)酸和產(chǎn)氣)、麥芽糖、甘露醇、黏液酸；不發(fā)酵蔗糖、乳糖、水楊酸、棉子糖。動(dòng)力(半固體)、MR、H2S、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)呈陽(yáng)性；尿素酶、V-P、吲哚試驗(yàn)呈陰性。參照生化鑒定試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判斷，結(jié)果表明該分離菌為沙門氏菌。

2.4.2 血清學(xué)鑒定結(jié)果 沙門氏菌A～F 多價(jià)O血清與分離的該株致病菌混合表現(xiàn)凝聚反應(yīng)，沙門氏菌O4單價(jià)血清因子與分離得到的該株致病菌能發(fā)生凝集反應(yīng)，且生理鹽水作為陰性對(duì)照無(wú)凝集。分離菌抗原式符合說(shuō)明書(shū)關(guān)于鼠傷寒沙門氏菌血清學(xué)抗原式的描述，初步鑒定該分離株為鼠傷寒沙門氏菌。

2.5 16S r RNA 序列分析鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,該分離菌株在約1 500 bp處擴(kuò)增出條帶(圖5)。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中以Blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)并建立遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖6)，與鼠傷寒沙門氏菌同源性為100%。

圖3 分離菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖4 分離菌株革蘭氏染色鏡檢(1 000×)

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)鏈霉素、呋喃妥因表現(xiàn)耐藥，對(duì)氨芐西林、阿莫西林、美羅培南表現(xiàn)敏感(表1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.疑似沙門氏菌樣本DNA；2.陰性對(duì)照

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

2.7.1 攻毒后的臨床癥狀和病理剖檢 靜脈注射的鴿子于感染后24 h出現(xiàn)精神萎靡、飲食欲下降，被毛松亂、身體顫抖、俯臥等癥狀，32 h后死亡?？诜ザ镜镍澴釉?8 h后出現(xiàn)食欲下降，精神沉郁，扎堆、呼吸困難，渾身無(wú)力，趴伏不動(dòng)等癥狀，在56 h后相繼死亡。肌肉注射的鴿子同樣在感染48 h后出現(xiàn)癥狀，癥狀與另外2個(gè)試驗(yàn)組鴿子相似，在感染70 h后死亡。對(duì)照組鴿子正常存活，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)。剖檢發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組肝臟腫大，病程較長(zhǎng)的胸腔有黃色纖維素性滲出，嗉囊內(nèi)也有黃色干酪樣物質(zhì)，腎臟和脾臟都有不同程度的腫大，口服方式攻毒的，在肌胃和腺胃交界處有出血，腺胃乳頭出血。

圖6 分離株與沙門氏菌參考株的16S rRNA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.7.2 攻毒鴿中的細(xì)菌分離與鑒定 將試驗(yàn)病鴿的肝臟、腎臟、心臟、脾臟分別接種到血平板中，不同臟器都可在血平板上培養(yǎng)出白色、濕潤(rùn)、中等大小的菌落，經(jīng)鑒定，與攻毒菌同源性達(dá)100%，不同攻毒組均可以分離到純凈的該菌株，表明該分離菌株可以通過(guò)動(dòng)物復(fù)制得到原有特征性剖檢病變。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

肉鴿通常在鴿舍中飼養(yǎng)，清晨被放飛，自由放養(yǎng)的方式進(jìn)行飼養(yǎng)，并經(jīng)常與其他鴿子一起飛行，因此飼養(yǎng)過(guò)程中容易誤食野生昆蟲(chóng)或飲用野外水源[15]。據(jù)報(bào)道，鴿子藏有60種不同的人類病原體，并導(dǎo)致176種人類確診疾病[16]。Osman K M等[17]報(bào)道可從鴿子中分離出沙門氏菌和其他腸道致病菌。Horn和Saifullah等亦是在健康野生鴿中分離到具有多重耐藥的沙門氏菌[15,18]。由此可見(jiàn)沙門氏菌在鴿群中是普遍存在的，其中，鴿源沙門氏菌病又主要由鼠傷寒型沙門氏菌引起。其自然宿主又為畜禽類，因此傳播廣泛，還可通過(guò)污染的畜禽產(chǎn)品感染人類。該菌的廣泛傳播已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類和動(dòng)物腸道健康，也嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展[19]。近年來(lái)，隨著特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，無(wú)論是信鴿還是肉鴿的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，鴿的各類傳染病的較以前也更為頻繁的出現(xiàn)，同時(shí)由于鼠傷寒沙門氏菌引起的細(xì)菌性傳染病，在傳播過(guò)程中出現(xiàn)了一些與以往不完全相同的病理特征以及各種耐藥性的問(wèn)題，這使鴿沙門氏菌病的診斷和治療變得更為棘手[20-21]。據(jù)報(bào)道，沙門氏菌屬有2個(gè)種，分為42個(gè)群，現(xiàn)有2 659種血清型[4]?，F(xiàn)階段雞源性沙門氏菌的研究較多，對(duì)其的分離鑒定、毒力和耐藥性等方面已經(jīng)有許多學(xué)者進(jìn)行了系統(tǒng)研究[22-24]，但對(duì)鴿源沙門氏菌的研究還十分有限[2]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)病鴿的剖檢，結(jié)合臨床癥狀的觀察，利用SS瓊脂培養(yǎng)基對(duì)各臟器中的菌種進(jìn)行分離、純化以及革蘭氏染色鏡檢獲得1株疑似致病菌的沙門氏菌。結(jié)合糖酵解試驗(yàn)、大分子物質(zhì)水解試驗(yàn)、生化試驗(yàn)初步鑒定為沙門氏菌。繼而進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果表明分離的沙門氏菌血清型為 A～O群，本試驗(yàn)與報(bào)道的江蘇地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型差異較大[25]。沙門氏菌的部分血清型具有垂直傳播性，能夠從咽喉或腸道侵入母體內(nèi)。具備這種垂直傳播能力的沙門氏菌血清型包括白痢沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[26]。為準(zhǔn)確鑒定該菌的種屬，對(duì)該株分離菌的16S rRNA 基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該分離株的16S rRNA序列與鼠傷寒沙門氏菌同源性達(dá)100%，鑒定該致病菌為鼠傷寒沙門氏菌。鼠傷寒沙門氏菌主要是通過(guò)水平傳播[4]，因此，保持鴿場(chǎng)的衛(wèi)生、設(shè)備和飼料的清潔和消毒種蛋，切斷傳播途徑對(duì)于該病的防治具有重要意義。

在鴿源沙門氏菌病中，凌育樂(lè)等[27]認(rèn)為主要病原是鼠傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌哥本哈根變種，后者更為多見(jiàn)[28-29]。但也有學(xué)者報(bào)道在鴿子中分離到的203株沙門氏菌中，鼠傷寒沙門氏菌就占有90.6%[30]，本試驗(yàn)分離到的菌株也為鼠傷寒沙門氏菌，所以流行性可能與不同時(shí)間和地區(qū)相關(guān)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該致病菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、美羅培南等幾種藥物有較高的敏感性, 在謝冠東等[9]的報(bào)道中，曾在鴿肉中分離得到對(duì)氨芐西林表現(xiàn)耐藥的的鼠傷寒沙門氏菌，但對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)敏感，說(shuō)明沙門氏菌在的耐藥性在不同環(huán)境或者養(yǎng)殖場(chǎng)中很可能具有很大的差異，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，必須測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，以此為選擇具有療效的藥物提供依據(jù)，才能迅速達(dá)到控制病情的目的，提高存活率，增加經(jīng)濟(jì)效益。這對(duì)禽病防治減少藥物浪費(fèi)具有重要意義[31]。動(dòng)物回歸試驗(yàn)組中，用其對(duì)10日齡鴿進(jìn)行人工感染，各攻毒方法均引起鴿子死亡。李雪雁等[21]對(duì)華南地區(qū)分離株進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離株對(duì)雛鴿的發(fā)病率100%，而病死率僅為17%，表明此次分離到的致病菌具有較強(qiáng)的毒性，同時(shí)可導(dǎo)致與送檢鴿子出現(xiàn)相似癥狀和剖檢結(jié)果，且不同攻毒組均可以分離到純凈的該菌株，表明該分離菌株可以通過(guò)本體動(dòng)物復(fù)制得到原有特征性剖檢病變。確定此次分離到的鼠傷寒沙門氏菌具有致病力。在肉鴿的養(yǎng)殖過(guò)程中，加強(qiáng)對(duì)沙門氏菌的監(jiān)測(cè)和防治是保障肉鴿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。此次分離到的致病性較強(qiáng)的菌株說(shuō)明在鴿場(chǎng)沙門氏菌有適宜的傳播傳代環(huán)境，需要鴿場(chǎng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好消毒工作。