動(dòng)物源大腸埃希氏菌耐藥機(jī)制及中藥對(duì)其耐藥性消減的研究進(jìn)展

王雅麗，張靈枝，李志君，韓曉霞，韓 洋，張為民*，卿素珠*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河南省鶴壁市第二中學(xué)，河南鶴壁 458000)

細(xì)菌耐藥性已然成為世界范圍內(nèi)廣為關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。意大利相關(guān)機(jī)構(gòu)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，2002年-2011年期間所分離的442株仔豬腹瀉源大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考和頭孢喹肟的耐藥率至少增加了42%，且耐6種以上抗菌藥物的多重耐藥菌株數(shù)呈顯著增加趨勢(shì)[1]。Fazel F等[2]對(duì)來(lái)自伊朗不同地區(qū)的奶牛場(chǎng)70株臨床乳腺炎奶牛源大腸埃希氏菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)47.1%的菌株至少攜帶一種氨基糖苷類抗性基因，62.9%菌株帶有多種耐藥基因。Radwan A等[3]從埃及肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中分離的98株大腸埃希氏菌呈100%多重耐藥性，其中對(duì)丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星等藥物的耐藥性在90%以上。Yu Z N等[4]對(duì)中國(guó)11個(gè)省規(guī)?；膛?chǎng)乳腺炎病例大腸埃希氏菌分離株進(jìn)行耐藥性差異調(diào)查，發(fā)現(xiàn)對(duì)青霉素、林可霉素和苯唑西林耐藥最為嚴(yán)重，而且所有菌株至少對(duì)3種抗菌藥物具有耐藥性。上述報(bào)道說(shuō)明大腸埃希氏菌耐藥已成普遍現(xiàn)狀。大腸埃希氏菌耐藥性的增強(qiáng)和多重耐藥細(xì)菌的增多不僅僅導(dǎo)致臨床疾病難以治療，而且細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移還會(huì)使細(xì)菌耐藥性廣泛蔓延。在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中大規(guī)模使用治療性和亞治療性抗生素使動(dòng)物腸道微生物群中的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)產(chǎn)生高選擇性的壓力，并產(chǎn)生了大量含抗生素的動(dòng)物糞便，將糞便施用于農(nóng)田，而導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌在農(nóng)作物、動(dòng)物和人類之間傳播[5]。Guo T等[6]通過(guò)對(duì)灌溉豬糞2年的土地表層的土壤進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施肥會(huì)造成重金屬污染以及抗生素殘留，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)ARGs與土壤中抗生素-重金屬污染的程度呈正相關(guān)。

腸桿菌科對(duì)抗生素的高耐藥性使得研究消減其耐藥性的生物學(xué)措施成為近年各國(guó)研發(fā)的熱點(diǎn)，而針對(duì)中藥在這方面的相關(guān)研究也愈來(lái)愈得到關(guān)注。在畜禽養(yǎng)殖和疫病防治方面也進(jìn)行了積極的探索，如黃芩苷(baicalin)能夠降低鏈霉素(25.0%)、環(huán)丙沙星(19.6%)和青霉素(12.5%)等抗菌藥物對(duì)從乳汁中分離出的大腸埃希氏菌的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)[7]；酸藤果(Embeliaribes)提取物和海藻(seaweed)提取物與抗生素聯(lián)合使用都能夠顯著抑制大腸埃希氏菌生長(zhǎng)，降低其耐藥性[8-9]。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在動(dòng)物源大腸埃希氏菌耐藥機(jī)制及中藥對(duì)其耐藥性消減作用方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 大腸埃希氏菌耐藥機(jī)制

細(xì)菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，往往是多種耐藥機(jī)制同時(shí)存在或者協(xié)同作用。研究表明，動(dòng)物源大腸埃希氏菌的耐藥性產(chǎn)生主要涉及質(zhì)粒介導(dǎo)、靶位點(diǎn)改變、產(chǎn)生作用于抗生素的酶、藥物滲透障礙、形成生物被膜等5個(gè)方面。

1.1 質(zhì)粒介導(dǎo)

細(xì)菌耐藥基因是決定耐藥表型的重要因素，通過(guò)自身基因突變和從外界兩種方式得到，其主要的傳播方式是質(zhì)粒介導(dǎo)。質(zhì)粒是除了染色體之外能自我復(fù)制的DNA環(huán)，可以攜帶一種或多種耐藥基因，可通過(guò)轉(zhuǎn)化等多種方式在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥強(qiáng)度、加速耐藥性的擴(kuò)散。自2015年發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素抗藥性基因(mobile colistin resistance,mcr-1)以來(lái)，已經(jīng)先后在多種腸桿菌科、食品和動(dòng)物以及人類中都檢測(cè)到相同mcr-1基因[10]，它不僅能夠在腸桿菌科的其他流行株內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且動(dòng)物源大腸埃希氏菌中mcr-1攜帶率明顯高于人源攜帶率，表明耐藥質(zhì)粒傳播導(dǎo)致的隱患很大，抗性基因很可能起源于動(dòng)物再傳播給人類。

1.2 靶位點(diǎn)改變

青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)是β-內(nèi)酰胺類抗生素與細(xì)菌作用的靶標(biāo)酶，具有高度保守的催化活性，參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖(PG)的交聯(lián)合成，藥物與PBPs結(jié)合后，阻礙細(xì)胞壁形成致細(xì)胞溶解而細(xì)菌死亡[11]，PBPs結(jié)構(gòu)改變、表達(dá)減少等異?，F(xiàn)象是大腸埃希氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類產(chǎn)生耐藥性的重要原因。喹諾酮類藥物通過(guò)與細(xì)菌的DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)菌染色體斷裂干擾轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制菌體正常生長(zhǎng)，編碼DNA螺旋酶的GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的ParC基因突變是導(dǎo)致大腸埃希氏菌對(duì)喹諾酮耐藥的主要原因。

1.3 產(chǎn)生作用于抗生素的酶

大腸埃希氏菌可通過(guò)產(chǎn)生使抗生素結(jié)構(gòu)破壞的酶，導(dǎo)致抗生素活性降低或失去活性而表現(xiàn)細(xì)菌耐藥性。第一類是β-內(nèi)酰胺類酶(β-lactamase)，大腸埃希氏菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類酶以水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的活性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致藥物失去抗菌活性，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)的存在是導(dǎo)致大腸埃希氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素不敏感的主要原因。第二類是氨基糖苷類修飾酶(aminoglycoside modifying enzyme,AMEs)，包括N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，通過(guò)共價(jià)修飾藥物上的特定氨基或羥基來(lái)滅活氨基糖苷類抗生素，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。第三類是四環(huán)素鈍化酶(Tet(X4))，在抗生素的壓力下產(chǎn)生的由tetX基因編碼的通過(guò)降解四環(huán)素使其失去活性的酶[12]。

1.4 藥物滲透障礙

藥物滲透障礙主要分為2種，其一是改變細(xì)胞膜通透性，減少藥物進(jìn)入菌體的濃度;其二是大腸埃希氏菌存在主動(dòng)(能量來(lái)源為ATP水解或者質(zhì)子驅(qū)動(dòng))識(shí)別和泵出自身代謝廢物以及菌體環(huán)境中的毒性化學(xué)物質(zhì)的蛋白外排泵(efflux pump,EP)系統(tǒng)，其過(guò)程經(jīng)膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、外膜通道蛋白及二者間的輔助蛋白的相互作用，直接減少到達(dá)作用靶位的藥量，從而阻止藥物發(fā)揮殺菌或抑菌功能。AcrAB-TolC系統(tǒng)是大腸埃希氏菌常見(jiàn)的一種外排系統(tǒng)，由acrB基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)子、acrA編碼的連接AcrB到質(zhì)膜的兩種融合蛋白以及TolC外膜通道組成，EP活性受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MarA、MarB、MarR和應(yīng)激蛋白SoxS和Rob的調(diào)控，表達(dá)基因的過(guò)度上調(diào)和突變都會(huì)增大藥物的不敏感性，此外在酸性(pH 5)條件下，活性明顯更強(qiáng)[13]。

1.5 形成生物被膜

生物被膜(bacterial biofilm,BF)是微生物由其分泌的多糖蛋白復(fù)合物固著于各種表面、包裹群體菌落形成的聚集膜狀物，是保護(hù)細(xì)菌定植和入侵機(jī)體的重要機(jī)制。復(fù)雜的膜狀結(jié)構(gòu)使細(xì)菌一直處于低代謝水平并減弱了抗生素的滲透程度，導(dǎo)致抗生素不能殺滅深層菌群，同時(shí)低水平的抗生素持續(xù)作用會(huì)增加大腸埃希氏菌的藥物耐受度和影響抗性基因表達(dá)。大腸埃希氏菌BF形成過(guò)程主要需要特異性毒力黏附因子、胞外聚合物(EPS)以及群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)的參與，其中QS是生物膜發(fā)育成熟的關(guān)鍵，細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生小分子信息素(pheromone)-?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)來(lái)完成細(xì)菌細(xì)胞間行為和功能的交流和協(xié)調(diào)。csgD(正調(diào)節(jié)卷曲菌毛產(chǎn)生)、bcsA操縱子(催化胞外纖維素形成)、fimB(調(diào)控Ⅰ型菌毛)、flu(促進(jìn)黏附蛋白自動(dòng)凝集)、rpoS(應(yīng)激調(diào)節(jié)因子)以及QS相關(guān)基因luxS、mqsR、qseB、qseC、lsrK、lsrR等是參與BF結(jié)構(gòu)建立的基因，它們表達(dá)量的變化直接或間接調(diào)控BF形成，是導(dǎo)致大腸埃希氏菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因[14]。

2 中藥對(duì)大腸埃希氏菌耐藥性的消減作用

中藥具有多組分、抗菌活性廣泛和低殘毒特點(diǎn)，通常作用于多靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮抗菌或協(xié)同作用效果。目前，中藥抑制大腸埃希氏菌耐藥性機(jī)制研究主要集中在消除耐藥質(zhì)粒、改變細(xì)胞膜通透性、抑制酶(滅活酶或鈍化酶)活性、多藥外排泵和生物被膜形成等方面，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)報(bào)道。

2.1 消除耐藥質(zhì)粒

耐藥質(zhì)粒的獲得是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性最廣泛的機(jī)制，耐藥菌株可以通過(guò)質(zhì)粒(R-plasmid)并進(jìn)行轉(zhuǎn)移，以促進(jìn)抗生素耐藥性在細(xì)菌內(nèi)和細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移，有研究證明，某些植物的提取物能夠有效干擾耐藥質(zhì)粒穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)移，如粗糠柴(Mallotusphilippensis(Lam.) Mull.Arg.)提取物在亞抑制濃度下能夠顯著降低攜帶四環(huán)素、卡那霉素等抗性基因的質(zhì)粒在大腸埃希氏菌之間的共軛轉(zhuǎn)移能力，且植物不同成分抑制活性以及同一成分對(duì)不同耐藥菌株質(zhì)粒的消除效果均存在差異，最高轉(zhuǎn)移抑制率達(dá)99.7%[15]；生姜和辣椒中的主要刺激性成分姜醇(gingerol)和辣椒素(capsaicinoid)在濃度100 mg/L時(shí)能夠降低多種大腸埃希氏菌耐藥質(zhì)粒活性，對(duì)攜帶一種和多種抗性基因的質(zhì)粒均呈現(xiàn)出抑制效果，具有較廣泛的抑制效應(yīng)[16]；五倍子提取物與耐藥大腸埃希氏菌作用48 h能夠增強(qiáng)其對(duì)慶大霉素、卡那霉素等抗生素的敏感性，并消除一定程度的耐藥質(zhì)粒[17]。

2.2 對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)菌進(jìn)行外部刺激，物質(zhì)以及能量交換和代謝的場(chǎng)所，氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、氟喹諾酮類等抗菌藥物通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞膜與相應(yīng)靶點(diǎn)作用殺滅細(xì)菌，當(dāng)細(xì)胞膜通透性改變時(shí)，會(huì)使進(jìn)入菌體內(nèi)的含量下降，影響抗菌效果從而產(chǎn)生耐藥性，有研究證明中藥成分可以有效改善耐藥菌通過(guò)細(xì)胞膜通透性的改變來(lái)耐受抗菌藥物的現(xiàn)狀，柳葉臘梅(Chimonanthussalicifolius)醇提取物與鏈霉素聯(lián)用降低了大腸埃希氏菌磷消耗，破壞細(xì)胞質(zhì)膜完整性使大分子物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)溢出，并通過(guò)干擾翻譯過(guò)程抑制蛋白質(zhì)合成，影響菌體正常生長(zhǎng)過(guò)程以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)[18]；槲皮素(quercetin)能夠恢復(fù)耐藥大腸埃希氏菌對(duì)四環(huán)素類藥物的敏感性(MIC從4 μg/mL～256 μg/mL減至1 μg/mL～64 μg/mL)，與四環(huán)素聯(lián)合使用可以增加大腸埃希氏菌細(xì)胞膜通透性和藥物進(jìn)入菌體內(nèi)的濃度，使細(xì)胞皺縮變形從而殺滅細(xì)菌[19]；小檗(Berberis)莖皮提取物和茶(Camelliasinensis)葉提取物也可以靶向破壞耐碳青霉烯類大腸埃希氏菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并顯著降低其對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用[20]。

2.3 抑制酶的活性

耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的滅活酶或者鈍化酶通過(guò)水解作用使抗生素結(jié)構(gòu)改變失去活性，目前研究較為深入的就是β-內(nèi)酰胺酶，它的產(chǎn)生是大腸埃希氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因，包括絲氨酸依賴型酶和Zn2+依賴性酶2種類型，金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)是較為常見(jiàn)的一種β-內(nèi)酰胺酶。有研究證明紫檀芪(pterostilbene)與多黏菌素B協(xié)同作用1 h可消除大腸埃希氏菌mcr-1和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1)[21]；厚樸酚(magnolol)能夠快速阻斷底物與NDM-1的結(jié)合并導(dǎo)致酶失活[22]；黃芩苷同樣對(duì)NDM-1酶具有良好的抑制作用，并有效的恢復(fù)氨芐西林和頭孢呋辛鈉的抗菌活性[23]；蘆薈大黃素、槲皮素、香紫蘇醇、木犀草素、苦參堿、大蒜素和五味子甲素均可以顯著降低大腸埃希氏菌β-內(nèi)酰胺酶活性，且抑制效果隨濃度增加而增強(qiáng)，其中蘆薈大黃素和苦參堿在濃度90 μg/mL時(shí)抑酶率達(dá)到81.7%和60.4%，有效減少菌體內(nèi)β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素的水解，起到逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用[24]。

2.4 抑制耐藥細(xì)菌外排泵

隨著對(duì)耐藥菌株外排系統(tǒng)研究的深入，研發(fā)應(yīng)用高效外排泵抑制劑已成為減少細(xì)菌耐藥性的重要途徑。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者已發(fā)現(xiàn)并證實(shí)多種中藥提取物能抑制細(xì)菌外排泵并減少細(xì)菌耐藥性，如白藜蘆醇(resveratrol)具有減少AcrAB-TolC外排泵相關(guān)基因表達(dá)的能力，從而抑制大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)[25]；芍藥苷通過(guò)降低大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB的表達(dá)，減弱大腸埃希氏菌的外排泵活性并提高其對(duì)磷霉素鈉的敏感性[26]；麥盧卡蜂蜜(Manuka honey)能夠顯著減弱大腸埃希氏菌細(xì)胞活力，并以劑量依賴的方式抑制細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)，增強(qiáng)外排泵作用底物在菌體內(nèi)積聚[27]。

2.5 抑制生物被膜形成

生物被膜是細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)限制、抗生素作用等多種壓力下形成的有規(guī)律的生物群落系統(tǒng)，特殊的密集菌體生活可以促進(jìn)抗性基因在細(xì)菌間的水平傳播。Sun T等[28]用小檗堿(berberine)和苦參堿(matrine)處理耐藥大腸埃希氏菌菌株發(fā)現(xiàn)，二者均能通過(guò)降低luxS、pfS、hflX、motA和fliA等基因的表達(dá)從而抑制生物被膜形成，使大腸埃希氏菌細(xì)胞變形，且小檗堿的抑制效果強(qiáng)于苦參堿。黃芩苷能夠有效減少大腸埃希氏菌主要細(xì)菌黏附因子fimB的表達(dá)，并通過(guò)抑制毒力基因的表達(dá)來(lái)降低對(duì)細(xì)胞的黏附力從而降低生物被膜的形成[29]。穿心蓮(Andrographispaniculate)乙酸乙酯提取物(≥250 μg/mL)能夠顯著減少大腸埃希氏菌胞外多糖的產(chǎn)生，從而抑制生物被膜的形成，其抑制效果與抗生素相當(dāng)[30]。

除了上述5個(gè)方面的抗耐藥機(jī)制涉及的中藥外，還有許多植物及提取物也表現(xiàn)出抑制耐藥大腸埃希氏菌生長(zhǎng)的能力，如丁香酚(eugenol)能夠延緩耐多藥大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)期，破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在濃度為5 mg/mL時(shí)達(dá)到完全抑菌效果[31]，構(gòu)樹葉水提液能夠一定程度上抑制耐藥大腸埃希氏菌生長(zhǎng)，與土霉素、頭孢曲松鈉等聯(lián)合用藥抑菌效果更明顯[32]，但是目前這類中藥的消減耐藥性機(jī)制尚不明確，需深入研究。

3 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌耐藥性現(xiàn)狀嚴(yán)重且產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜多樣，目前中藥消減劑的篩選范圍往往僅限于對(duì)細(xì)菌具有一定抑制作用的中藥種類，所以多數(shù)中藥消減劑為抑菌作用較強(qiáng)的清熱類中藥。但由于抑菌與耐藥消減的機(jī)理存在差異，中藥抑菌能力的強(qiáng)弱與其對(duì)細(xì)菌耐藥性消減作用大小之間是否存在相關(guān)性尚無(wú)定論。目前，中藥消減劑的選擇存在針對(duì)性不強(qiáng)、效果不穩(wěn)定等問(wèn)題，要從根本上確定和增強(qiáng)中藥對(duì)細(xì)菌的耐藥消減效果，還需結(jié)合細(xì)菌耐藥產(chǎn)生機(jī)制深入探明中藥消減細(xì)菌耐藥性的作用途徑。