豬口腔液在豬病毒感染監(jiān)測中的初步應用

王 雪，趙 靜，阮 征，肖 冉，黎 巧，裴 潔，李婷婷，萬 云，岳 龍，張四化*

(1.武漢市動物疫病預防控制中心，湖北武漢 430014；2.湖北省動物疫病預防控制中心，湖北武漢 430070)

豬口腔液是由豬口腔中的唾液和黏膜滲出液組成的混合液體[1-2]，含有唾液腺、呼吸道和齒齦溝的分泌物如血清衍生抗體、激素、細菌、病毒等[3]，是一種高效、方便的群體疫病監(jiān)測樣品。研究表明，豬口腔液含有感染機體的病原和抗體[4-5]，很多病毒在感染機體后的窗口期，已經(jīng)存在于豬的口腔分泌物中，可作為多種豬病的早期診斷樣品[6]，多項研究應用常規(guī)PCR檢測口腔液中的病原核酸，如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[7-8]、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)[9]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[10]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)[11]、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)[12]、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)[13]、豬流感病毒(Swine influenza A virus，SIV)[14]、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)[15]等都可在豬口腔液中檢出。豬口腔液樣品采集較為簡單，可通過吸附性材料如棉繩等收集，由于豬天生好奇和嗜咀嚼，會主動接近并咬濕繩子，擠壓棉繩上的液體可獲得豬口腔液樣品[16-17]。相對于傳統(tǒng)的活體組織、血液等個體樣品，豬口腔液采集不需要保定動物，對動物無損傷、無應激，符合動物福利，對采樣人員的技術(shù)要求低，且一個樣品可覆蓋多頭豬、可連續(xù)重復采樣，能減少人力物力，有利于早期發(fā)現(xiàn)及診斷疫情[18]。目前大部分口腔液研究是基于檢測攻毒后的試驗豬，應用于實際豬場檢測病原的報道不多。為了解豬口腔液應用于豬場病原監(jiān)測的效果及采樣豬場主要豬病病毒的感染分布情況，在63家生豬養(yǎng)殖場以欄舍為單位采集豬口腔液樣品，結(jié)合熒光定量PCR和常規(guī)PCR分別檢測本地區(qū)常見的7種豬病病毒，即豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒1型和2型、豬偽狂犬病病毒，以初步探索利用豬口腔液開展豬場病原學監(jiān)測的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 豬口腔液樣品來源于2018年1月—12月武漢市6個行政區(qū)(縣)的63家豬場的325個豬欄，包含35個商品代養(yǎng)殖場的180個豬欄、19個種豬場的100個豬欄、4個養(yǎng)殖小區(qū)20個豬欄和5個豬散養(yǎng)戶的25個豬欄。

1.1.2 試劑盒和主要儀器 磁珠法病毒總核酸抽提試劑盒，美基生物科技有限公司產(chǎn)品；豬瘟病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Nsp2 1594-1680變異株)實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒1型和2型雙重PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Thermo KingFisher FLEX磁珠提取儀、ABI 7500型熒光PCR儀、Bio-Rad T100型PCR儀。

1.1.3 采樣用品 剪取100%純棉、直徑1.6 cm、長度1.2 m的繩子，滅菌后轉(zhuǎn)入無菌自封袋保存；剪刀、離心管使用前進行滅菌處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在全年4個季度、武漢市6個生豬養(yǎng)殖集中的行政區(qū)(縣)分別采集不同類型豬場的豬口腔液樣品。將棉繩懸掛于豬欄內(nèi)相對干凈的區(qū)域，遠離飼喂、飲水和排便區(qū)，不接觸墻壁和豬欄。棉繩上端打結(jié)固定，下端懸掛高度與豬身肩關(guān)節(jié)齊平，任豬自由啃咬30 min。戴上一次性無菌手套，將棉繩下端的濕潤部分放入一次性無菌自封袋中，用力擠壓袋內(nèi)棉繩，釋放口腔液至袋底。剪掉自封袋底部一角，將口腔液轉(zhuǎn)移至離心管中，置于低溫采樣運輸箱中運送。

1.2.2 樣品預處理 樣品送達實驗室后，4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，去除雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中，做好標記。

1.2.3 病原檢測 嚴格按照Magen磁珠法病毒總核酸抽提試劑盒對325份豬口腔液進行核酸提取，按各種病毒檢測試劑盒操作說明加入核酸樣品及相應試劑進行擴增。豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2 1594-1680變異株(HP-PRRSV)進行實時熒光RT-PCR擴增，豬偽狂犬病病毒(PRV)進行實時熒光PCR擴增，檢測樣品出現(xiàn)典型的S形擴增曲線且Ct值小于37.0時為陽性；豬圓環(huán)病毒1型和2型(PCV1和PCV2)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，擴增產(chǎn)物片段大小與陽性對照片段一致為陽性。

2 結(jié)果

2.1 7種病毒檢測結(jié)果

采用RT-PCR和常規(guī)PCR對所提取的豬口腔液核酸進行CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2和PRV的檢測，在325份豬口腔液中，檢出CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1和PCV2，PCV的檢出率最高，尤其是具有致病性的PCV2，共檢出PCV2陽性樣品83份，陽性率為25.54%，其次是PCV1，陽性樣品為45份，陽性率是13.85%，PRRSV、FMDV、HP-PRRSV、CSFV的陽性率分別為7.38%、3.69%、0.92%和0.31%，PRV在口腔液的檢出率為0。7種病毒的檢測結(jié)果見圖1。

圖1 7種病毒檢測陽性率

2.2 4個季度病毒檢測結(jié)果

分別在全年的4個季度采集豬口腔液樣品，4個季度采集的樣品數(shù)量差異不大，第1季度采集85份，其他3個季度各80份。第1季度檢出CSFV、FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2共6種病毒，第3季度檢出FMDV、PRRSV、HP-PRRSV、PCV1、PCV2共5種病毒感染，第2季度、第4季度檢出FMDV、PRRSV、PCV1、PCV2共4種病毒；CSFV僅在第1季度檢出，陽性率為0.31%，F(xiàn)MDV、PRRSV、PCV1、PCV2在4個季度均有檢出，HP-PRRSV僅在第1和第3季度檢出，陽性率分別為2.35%和1.25%；PRRSV在第1季度的陽性率最高(14.12%)，F(xiàn)MDV、PCV2在第2季度陽性率最高，陽性數(shù)分別為7份、36份，陽性率分別為8.75%和45.00%，PCV1在第3季度陽性率比PCV2高，為23.75%。4個季度各種病毒的檢測結(jié)果見圖2。

2.3 不同類型場點病毒檢測結(jié)果

為了解不同類型場點的病毒感染情況，此次豬口腔液采集的場點包含商品代養(yǎng)殖場、種豬場、養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶，樣品量占比見表1，所有樣品經(jīng)核酸檢測后顯示，商品代養(yǎng)殖場、種豬場檢出的病毒種類比養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶多。CSFV、HP-PRRSV僅在商品代養(yǎng)殖場檢出，F(xiàn)MDV在商品代養(yǎng)殖場和種豬場檢出，散養(yǎng)戶僅能檢出PCV1和PCV2。不同類型場點PCV2檢測陽性率均較高，散養(yǎng)戶的陽性率最高，高達36.00%。不同類型場點的豬口腔液病毒檢測結(jié)果見圖3。

圖2 不同季度病毒檢測陽性率

表1 不同類型場點采集的樣品量占比

1.商品代養(yǎng)殖；2.種豬場；3.養(yǎng)殖小區(qū)；4.散養(yǎng)戶

2.4 不同行政區(qū)病毒檢測結(jié)果

為了解通過豬口腔液監(jiān)測不同地域豬群病毒感染情況的可行性，此次樣品按存欄比例分布在6個主要生豬集中的行政區(qū)(縣)，不同區(qū)的樣品量占比見表2，樣品采集后經(jīng)病毒核酸檢測，結(jié)果顯示，6個區(qū)均存在PCV1和PCV2的感染，其中PCV1以A區(qū)和B區(qū)陽性率最高，陽性率分別為22.50%、45.00%，PCV2以A區(qū)和E區(qū)檢測陽性率最高，分別為35.00%、33.33%，F(xiàn)MDV在A、D、E和F 4個區(qū)檢出，HP-PRRSV僅在A區(qū)和C區(qū)檢出，CSFV僅在C區(qū)檢出(圖4)。PCV1陽性場點占抽樣場點的31.75%，PCV2陽性場點占抽樣場點的53.97%，PCV1和PCV2混合感染占23.81%，說明養(yǎng)殖區(qū)普遍存在豬圓環(huán)病毒2型感染(表3)。

表2 不同區(qū)采集的樣品量占比

圖4 不同區(qū)病毒檢測陽性率

表3 PCV1/PCV2陽性場占比

3 討 論

早期病原監(jiān)測是評估群體感染風險和動物疫病凈化消除的有效手段，對減少動物疫病的傳播和影響具有重要意義。動物分泌液作為監(jiān)測動物健康和疫病的新興遞質(zhì)，在疾病早期診斷中具有明顯的作用[19]。豬口腔液作為一種動物分泌液，已廣泛應用于多種豬病的病原檢測或抗體測定。研究證實，多種豬傳染性病原體通過口腔排毒，可能與口腔中病毒的定殖組織或循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)黏膜滲出的物質(zhì)有關(guān)，因此口腔液中含有機體感染后的病原，甚至有些病毒優(yōu)先于血液檢出，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒[17]、非洲豬瘟病毒[20]、水皰性口炎病毒[21]等。本文采集的豬群均為臨床正常豬，檢出病原核酸提示豬可能處于感染后的排毒期或潛伏期，應用豬口腔液開展病毒早期監(jiān)測具有可行性?？谇灰菏且环N群體監(jiān)測樣品，一個樣品可覆蓋一個豬欄多頭豬，一旦檢出陽性則可作為早期診斷的證據(jù)，而血清學監(jiān)測需采集豬欄中的每頭豬才能達到相同效果。對周期性監(jiān)控疫病來說，血清學監(jiān)測對動物的刺激性較大，不易重復采樣，對采集人員的技術(shù)要求也比較高，而豬口腔液樣品易于開展后續(xù)多項試驗，養(yǎng)殖業(yè)主可通過重復獲取并檢測豬口腔液持續(xù)監(jiān)測豬群不同階段的疫病狀態(tài)[22]。據(jù)報道[12,23]，PCR方法檢測口腔液樣品與檢測血清樣品相比，病原檢出陽性率更高、檢出時間更早。

以欄舍為單位懸掛棉繩由豬啃咬后收集豬口腔液樣品，結(jié)合分子生物學方法監(jiān)測豬群病毒感染情況，結(jié)果顯示，在檢測的生豬養(yǎng)殖場中，口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環(huán)病毒均能檢出(圖1)，尤其在春季這幾種病毒的檢出率較高(圖2)，這可能與病毒在低溫環(huán)境下更易存活有關(guān)，也可能與引種調(diào)運導致的病原輸入相關(guān)；口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒在春夏交替之際的檢出率較高，晝夜溫差大、濕度高可能是導致這兩種病毒檢出率高的原因。不同場點檢測結(jié)果提示，規(guī)?；B(yǎng)殖場檢出的病毒種類比養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶多，推測是受群體數(shù)量、種源及養(yǎng)殖密度影響，群體量大、種源復雜、養(yǎng)殖密集易造成病毒在群間傳播，病毒感染風險也隨之增加。另外，養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶的樣本量少(6.15%和7.69%)也是導致散戶病毒種類檢出低的主要原因(表1)。

豬圓環(huán)病毒的檢出率普遍較高，尤其是致病性更高的PCV2(圖1)，全年4個季度均能檢出(圖2)，存在于不同區(qū)(圖4)，雖然散養(yǎng)戶采集的樣本量少，但PCV2的檢測陽性率卻最高(圖3)，提示本地區(qū)尤其是散養(yǎng)環(huán)節(jié)可能存在廣泛的PCV2污染。豬圓環(huán)病毒主要通過鼻液、口腔液、糞便、尿液排毒，可在血清、組織(淋巴結(jié)、肺、扁桃體、腎、肝、心)等檢出[22,24]，可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征，一般情況下，感染PCV2僅引起亞臨床表現(xiàn)，但可導致豬群產(chǎn)生嚴重的免疫抑制，從而繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病。豬偽狂犬病病毒在試驗中未檢出，結(jié)合本地區(qū)gE抗體監(jiān)測情況，理論上能檢測到病毒，零檢出的原因可能是，試驗采集豬群主要為育肥豬、成年豬，感染PRV后一般癥狀較為輕微，耐過后可建立潛伏感染，此時并不向外界環(huán)境散發(fā)病毒[24]，口腔液中檢出病毒的概率較低。潛伏感染期豬偽狂犬病病毒DNA以附體的形式出現(xiàn)或插入感染部位(三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和肺扁桃體等)的基因組中，但在應激因子的刺激下可重新產(chǎn)生感染性病毒粒子，并通過口、鼻及生殖道分泌物等途徑向外排毒[25]。李段[26]用PCR檢測豬偽狂犬病陽性豬場不同階段豬群的鼻拭子、肛拭子、唾液等樣品，鼻拭子、肛拭子和唾液樣品PRV的陽性率分別為6.21%、5.65%和0.55%。Panyasing Y[13]用PCR檢測PRV攻毒豬的口腔液，發(fā)現(xiàn)攻毒后3 d～21 d PRV陽性率在20%～100%之間。推測當豬處于排毒期時，口腔液可檢測到病毒。豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、口蹄疫病毒雖然在試驗中的檢出率不高，但這幾種病毒對養(yǎng)殖業(yè)的危害較大，通過豬口腔液對規(guī)?；i場病原普檢，可提前做出綜合防控措施。

試驗結(jié)果表明，豬口腔液可用于檢測豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒，采集豬場存在普遍的豬圓環(huán)病毒感染，以欄舍為單位采集豬口腔液用于豬場病原監(jiān)測具備可行性。