加減益經(jīng)湯對(duì)DOR模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

★ 萬(wàn)云慧 萬(wàn)云云 陶莉莉 陳曉勇（.江西省婦幼保健院中醫(yī)科 南昌 0006；.南昌縣人民醫(yī)院產(chǎn)科 南昌 000；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 廣州 50405）

卵巢的功能包括：產(chǎn)生并排出卵子和分泌女性性激素［1］。卵巢的這兩大功能下降則稱為卵巢功能低下（diminished ovarian reserve，DOR)，臨床表現(xiàn)為<40歲的女性出現(xiàn)低的生育力及一系列女性性激素缺乏的臨床表現(xiàn)。近來(lái)，DOR的發(fā)病年齡越來(lái)越年輕化，發(fā)病率逐年上升，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此治療上也給臨床醫(yī)生帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。日前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用激素人工周期治療，但其治療的副作用及某些疾病限制了其使用。既往的臨床研究結(jié)果顯示加減益經(jīng)湯能夠改善DOR患者的卵巢功能，但其治療機(jī)制尚不明確。因此本研究將從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究方面來(lái)闡述加減益經(jīng)湯治療DOR的作用機(jī)理，以期為加減益經(jīng)湯臨床治療DOR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 本實(shí)驗(yàn)中藥加減益經(jīng)湯藥物的主要成分如下：熟地 20 g，菟絲子 20 g，當(dāng)歸 10 g，白芍 10 g，丹參 15 g，黨參 20 g，柴胡 6 g共 9 味。將這些藥物煎煮濃縮為每毫升含生藥1.18 g的藥液。補(bǔ)佳樂(lè)：每片含戊酸雌二醇1 mg。由拜爾醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組方法 將這些SD雌性大鼠適應(yīng)性地喂養(yǎng)7 d后，選出動(dòng)情周期為4～5 d的大鼠共120只，隨機(jī)分成4組，每組30只：空白組、模型組、中藥組、西藥組。

1.4 大鼠卵巢功能損害模型的建立 空白組大鼠給予0.9 %生理鹽水共1 mL腹腔單次注射，剩下的3組大鼠給予環(huán)磷酰胺（CTX）75 mg·kg-1單次腹腔注射。每組的大鼠都每天在相同的時(shí)間取其陰道分泌物涂片以觀察其動(dòng)情周期。

1.5 飼養(yǎng)及給藥方法 各組大鼠均提案按基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)、自由喝水。腹腔注射2 h后開始給各組大鼠灌胃，空白組和模型組：均給予2 mL的0.9 %生理鹽水灌胃；中藥組：加減益經(jīng)湯臨床日用量131 g生藥，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物臨床等效劑量，采用中劑量，即大鼠予11.8 g·kg-1生藥灌胃；西藥組：臨床補(bǔ)佳樂(lè)常規(guī)日用量1 mg，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動(dòng)物臨床等效劑量，予0.09 mg·kg-1補(bǔ)佳樂(lè)灌胃。每組均1天1次，共連續(xù)灌胃4周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo) 每組于灌胃給藥后的第4、6、8周，分別處死10只在動(dòng)情間期的SD雌性大鼠。

（1）大鼠的基本情況：各周注意查看SD大鼠的皮毛、飲食、精神及大鼠體重變化情況。

（2）大鼠的動(dòng)情周期：開始灌胃后，每天給予大鼠的陰道脫落細(xì)胞涂片，經(jīng)過(guò)蘇木素伊紅染色后，觀察大鼠的動(dòng)情周期變化。

（3）血清激素的檢測(cè)：所有的SD大鼠經(jīng)眼眶后靜脈叢或股靜脈采血，采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）檢測(cè)各組SD大鼠血清中的AMH，INHB，ACTA，F(xiàn)S的水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得資料輸入電子計(jì)算機(jī)，應(yīng)用軟件 SPSS 17.0 for windows進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分析所得的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示；均數(shù)比較前行方差齊性檢,兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 自身前后對(duì)照的比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在大數(shù)據(jù)的背景下，教學(xué)環(huán)境也開始向信息化的方向發(fā)展。因此，對(duì)于高職院校而言，也應(yīng)該積極地利用大數(shù)據(jù)的這一優(yōu)勢(shì)，建立相關(guān)的數(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，提高學(xué)生的數(shù)學(xué)實(shí)際操作能力。對(duì)于學(xué)生來(lái)說(shuō)，信息化數(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的建立不僅能力吸引到他們的學(xué)習(xí)興趣，也能夠提高實(shí)際的數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)效果，培養(yǎng)他們的數(shù)學(xué)應(yīng)用能力。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的基本情況 灌胃用藥的過(guò)程中,各組的SD大鼠全部都存活。經(jīng)CTX腹腔注射造模后的各組SD大鼠全部出現(xiàn)了精神萎靡、行動(dòng)困難、呼吸短促、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)次數(shù)減少、四肢乏力、攝水和攝食量明顯減少，被毛稀松、蜷縮弓背、無(wú)光澤，小便清長(zhǎng)、大便溏薄等癥狀，解剖SD雌性大鼠均出現(xiàn)內(nèi)臟淤血的情況。各給藥組在治療6周后以上各項(xiàng)一般情況基本恢復(fù)正常，與空白組大鼠比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。

2.2 大鼠的動(dòng)情周期

2.2.1 空白組 空白組的SD雌性大鼠陰道涂片顯示均有相對(duì)比較規(guī)則的動(dòng)情周期變化，周期為4～5 d，動(dòng)情間期為 1.5～2.5 d。

2.2.2 模型對(duì)照組 CTX造模后第4周，模型組的SD雌性大鼠在陰道涂片顯示已無(wú)規(guī)則的動(dòng)情周期，動(dòng)情周期延長(zhǎng)至7～16 d不等。陰道涂片結(jié)果顯示分泌物量少，散在的白細(xì)胞較多，少量的上皮細(xì)胞，偶有少量的有核細(xì)胞和角化細(xì)胞，動(dòng)情間期時(shí)間為5～7 d。

2.2.3 治療組 中藥組和西藥組第4、6、8周后恢復(fù)至正常的動(dòng)情周期。

2.3 對(duì)大鼠血清激素水平的影響

2.3.1 對(duì)DOR大鼠血清AMH水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中AMH的水平在第4、6、8周均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明DOR大鼠模型造模成功。與模型組比較，中藥組和西藥組SD雌性大鼠血清AMH水平在第4、6、8周均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。見表1。

表1 大鼠血清AMH的變化（ ，n=10）

2.3.2 對(duì)DOR大鼠血清INHB水平的影響 與空白組比，較模型組的SD雌性大鼠血清INHB的水平在造模后第4、6、8周均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，中藥組和西藥組SD雌性大鼠血清INHB的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與空白組比較，中藥組SD雌性大鼠血清INHB的水平在第8周恢復(fù)正常水平（P>0.05）。見表2。

表2 大鼠血清INHB的變化（ ，n=10）

2.3.3 對(duì)大鼠血清ACTA水平的影響 與空白組比較，模型組的SD雌性大鼠血清ACTA的水平在第4、6、8周均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，中藥組SD雌性大鼠血清ACTA在第4、6、8周均下降（P<0.05或P<0.01）。與空白組比較，中藥組SD雌性大鼠血清ACTA在第4周恢復(fù)至正常水（P>0.05），西藥組大鼠血清ACTA在造模后第8周恢復(fù)至正常水平（P>0.05）。見表3。

表3 大鼠血清ACTA的變化（ ，n=10）

2.3.4 DOR大鼠血清FS水平的影響 與空白組比較，模型組SD雌性大鼠血清FS的水平在第4、6周均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，中藥組SD雌性大鼠血清FS水平在第4、6周升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與空白組比較，中藥組和西藥組SD雌性大鼠血清FS水平在第4周恢復(fù)正常水平（P>0.05）。見表4。

表4 大鼠血清FS的變化（ ，n=10）

3 討論

INHB、ACTA和FS都為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族的成員，能夠調(diào)節(jié)垂體及卵巢的內(nèi)分泌功能，對(duì)于維持正常的女性生殖功能起到了重要的作用［2］。Veronica等［3］首次提出的 INHACT-FS這一系統(tǒng)。INHB是由卵巢竇卵泡中顆粒細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，可以反饋性抑制 FSH的分泌情況，調(diào)節(jié)患者的生殖功能［4］。對(duì)于DOR患者來(lái)說(shuō)，血清FSH水平升高，而血清INHB 水平降低［5-6］。ACTA也是由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的，能夠刺激垂體分泌FSH，提高FSH受體的表達(dá)，抑制LH刺激卵泡膜細(xì)胞分泌雄性激素的作用。ACTA廣泛參與了卵泡發(fā)育、激素合成以及維持卵巢功能等過(guò)程，并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。FS主要是由垂體細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞分泌合成的，是ACTA的特異性結(jié)合蛋白，對(duì)卵泡的作用,與ACTA相反，可以抑制FSH的合成及分泌［8］。周衛(wèi)琴等［9］的研究顯示INH-ACT-FS系統(tǒng)的功能失調(diào)有可能會(huì)引起排卵障礙性不孕，INH-ACT-FS系統(tǒng)功能狀態(tài)也可以直接用于卵巢儲(chǔ)備功能的評(píng)估。國(guó)外學(xué)者顯示，INH-ACT-FS系統(tǒng)的旁分泌行為能調(diào)控顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的功能，該系統(tǒng)功能的異常，能夠直接引起顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞功能的失常，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟，最終導(dǎo)致DOR、POF發(fā)生［10］。

AMH也是TGF-β超家族的成員之一，是由卵巢中的竇前卵泡和竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞分泌的一種蛋白激素，與女性的卵巢功能密切相關(guān)。AMH可以調(diào)控卵泡的初始募集、循環(huán)募集，而且能夠抑制原始卵泡的消耗能［11］。AMH的水平在月經(jīng)周期中變化不大，也不受外源性類固醇激素等藥物因素及妊娠等生理變化的影響［12-13］。所以AMH可以作為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的一個(gè)非常穩(wěn)定的標(biāo)志物。

加減益經(jīng)湯是在傅青主創(chuàng)制的益經(jīng)湯的基礎(chǔ)上變化而來(lái)，其功效是：補(bǔ)腎健脾、疏肝活血、清養(yǎng)心肺。方中菟絲子、熟地益精填髓、滋補(bǔ)肝腎，柴胡、黨參疏肝健脾；當(dāng)歸、丹參、白芍補(bǔ)血活血、養(yǎng)血柔肝、清養(yǎng)心肺。其中大部分藥物在現(xiàn)代藥理學(xué)上都具有抗衰老或調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用，該方在臨床上運(yùn)用多年，能夠明顯改善DOR患者的臨床癥狀和卵巢功能。既往的臨床研究已表明其能改善DOR患者的卵巢功能［14］。李麗美等［15］的研究證實(shí)加減益經(jīng)湯可明顯改善腎虛肝郁證 DOR 患者得卵巢功能，降低bFSH、bLH，升高bE2、AMH，增加AFC，副作用少。但對(duì)于加減益經(jīng)湯治療DOR的機(jī)理尚不明確，尚缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示經(jīng)CTX造模后SD雌性大鼠出現(xiàn)了鼠血清AMH水平下降，說(shuō)明CTX使大鼠的卵巢功能下降，和以往研究文獻(xiàn)結(jié)果一致［16］；而且出現(xiàn)了血清INHB和FS水平下降，而血清ACTA水平的增加，說(shuō)明CTX能使SD雌性大鼠INHB-ACTA-FS系統(tǒng)功能下降。而經(jīng)加減益經(jīng)湯治療后，DOR模型大鼠血清AMH水平升高，說(shuō)明加減益經(jīng)湯可以升高DOR模型大鼠血清AMH的水平，再一次證實(shí)了加減益經(jīng)湯能夠改善卵巢功能。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加減益經(jīng)湯可以升高大鼠血清INHB、FS水平，降低ACTA水平,表明加減益經(jīng)湯能提高DOR模型大鼠INHB-ACTA-FS功能。由此推測(cè)，加減益經(jīng)湯可能能夠通過(guò)改善INHACT-FS功能來(lái)改善DOR患者的卵巢功能。

本研究從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究方面證實(shí)了加減益經(jīng)湯治療DOR的作用，揭示了加減益經(jīng)湯能夠通過(guò)改善INH-ACT-FS 系統(tǒng)功能來(lái)治療DOR患者，為加減益經(jīng)湯臨床治療DOR提供了一定的理論依據(jù)，推進(jìn)了臨床能夠廣泛應(yīng)用加減益經(jīng)湯治療DOR。