量子點熒光免疫檢測牛奶中己烯雌酚、雌二醇

云瀚漩，蓋雪姣，韓振宇，劉明珠，范龍興，張櫻櫻，白家磊，寧保安，劉穎*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所，天津 300050；3.福州大學化學學院食品安全與生物分析教育部重點實驗室，福建 福州 350116）

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一種人工合成的非甾體雌激素，常在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被作為促生長劑使用，易在動物肝臟、脂肪、肌肉、乳汁中沉積[1-2]。DES已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構列為一類致癌物，接觸后甚至可對后代產(chǎn)生致癌影響[3]。與DES不同，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）為天然類固醇雌激素[4]，具有較高活性[5]，已有研究證明牛羊體內(nèi)的雌激素可釋放至乳汁中[6]，攝入過量會影響代謝和發(fā)育，增大腫瘤的發(fā)生風險[7-9]，引起一系列健康問題。

目前，常用于檢測食品中雌激素的方法包括色譜法[10-11]、電化學分析法[12-13]、免疫分析法[14-15]等。色譜法具有較高靈敏度，但儀器體積較大，對操作要求高，針對復雜樣品的前處理工作繁雜，不適合現(xiàn)場快速檢測。電化學分析法在保證靈敏度的前提下操作簡單，但對目標物的電活性有一定要求[16]，穩(wěn)定性和特異性均欠佳。傳統(tǒng)免疫分析法檢測時間較長，需接觸危險試劑，對操作人員健康存在隱患。因此，研究一種快速便攜、靈敏度高、特異性好、健康安全的方法用于牛奶中雌激素現(xiàn)場檢測具有重要意義。

量子點（quantum dots，QDs）具有光學性質(zhì)穩(wěn)定、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、粒徑和發(fā)射光譜可調(diào)節(jié)等優(yōu)點。通過在QDs核殼表面修飾不同基團，可實現(xiàn)其與生物大分子的偶聯(lián)[17]，進而用于定量檢測不同目標物[18-19]。

本文以傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的原理為依托，用QDs代替辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗，建立了牛奶中DES的熒光免疫檢測法，同時用該原理建立了牛奶中E2的檢測方法，優(yōu)化檢測條件后，均得出較低檢測限。與傳統(tǒng)ELISA相比，該方法所需時間更短，操作更加安全，可作為傳統(tǒng)方法的補充用于實際樣品現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

96孔黑色底透酶標板：ThermoFisher公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：Sigma公司；CdSe/ZnS雜化QDs標記的羊抗小鼠二抗（QDs-antibody2，QDs-Ab2，1mg/mL，激發(fā)波長307nm，發(fā)射波長 625nm）：上海昆道生物技術有限公司；DES完全抗原（4.0mg/mL）、抗DES單克隆抗體（7.7mg/mL）、E2完全抗原（9.7mg/mL）、抗E2單克隆抗體（6 mg/mL）：山東綠都生物科技有限公司；DES標準品及其類似物（100 μg/mL）、E2標準品及其類似物（100 μg/mL）：北京百靈威科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M5多功能酶標儀：Molecular Devices公司；F97Pro熒光分光光度計：上海棱光技術有限公司；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：中國森信公司；6410B液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原抗體濃度優(yōu)化

將抗原抗體按照梯度稀釋后做方陣滴定試驗，稀釋體積比例依次為1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8 000、1 ∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000。從結果中選取熒光響應值較高且梯度良好的抗原抗體濃度做間接競爭熒光免疫檢測，將靈敏度較高、熒光響應較好的濃度作為抗原包被濃度和一抗?jié)舛扔糜跇藴是€建立。靈敏度參考競爭抑制率，競爭抑制率/%=F/F0×100，F(xiàn)為添加目標物的陽性組熒光值，F(xiàn)0為未添加目標物的陰性組熒光值[20]。

1.3.2 二抗?jié)舛葍?yōu)化

將量子點標記二抗分別稀釋50倍、100倍、150倍、200倍用于試驗，參考結合信噪比優(yōu)化濃度[21]。

1.3.3 緩沖液濃度優(yōu)化

分別配制5%、10%、15%、20%甲醇磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），用于小分子標準品的配制，分別做間接競爭試驗，結合熒光響應和靈敏度選擇最適濃度。

1.3.4 緩沖液pH值優(yōu)化

分別配制 pH 值為 6.4、6.8、7.2、7.6、8.0 的甲醇PBS緩沖液，溶解小分子后做競爭試驗，優(yōu)化檢測最適酸堿度。

1.3.5 封閉液優(yōu)化

配制1%、2%、3%的BSA溶液作為封閉液，分別用于競爭試驗進行濃度優(yōu)化。

1.3.6 標準曲線建立

將優(yōu)化后的抗原濃度作為包被濃度，用碳酸鹽緩沖溶液（carbonate buffer solution，CBS）稀釋后加入96孔板，100 μL/孔，4℃過夜。用磷酸鹽緩沖液+0.1%吐溫 20清洗 3次后加入封閉液（1%BSA），160 μL/孔，37℃封閉1 h后再次洗滌。將小分子標準品和抗雌激素抗體（抗體稀釋液稀釋）依次加入96孔板中，各50 μL/孔，37 ℃孵育 1 h。洗液洗滌后加入 QDs-Ab2，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗液清洗后用多功能酶標儀檢測。

1.3.7 特異性試驗

配制雌激素類似物雌三醇（striol，E3）、雙酚 A（bsphenol A，BPA）、己烷雌酚（hexoestrolum）小分子標準液，用于競爭試驗，評價檢測方法對目標物的特異性。

1.3.8 加標回收試驗與方法學比較

于牛奶樣品中加入不同濃度小分子標準液，濃度依次為 DES 1、10、100 ng/mL，E2 0.5、5、50 ng/mL，渦旋混勻后4 000 r/min離心10 min，重復兩次，取上清液作為樣品進行檢測，評價回收率。

為了驗證研究所建立方法結果的可靠性與性能優(yōu)勢，將結果與液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測結果進行比較，評價方法性能。

物流傳輸一體化：通過區(qū)內(nèi)與各個化學反應裝置連成一體的專用輸送管網(wǎng)以及倉庫、碼頭、鐵路和道路等一體化的物流運輸系統(tǒng)，將區(qū)域內(nèi)的原料、能源和中間體安全、快捷地送達目的地。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2018處理數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行擬合并作圖。

2 結果與分析

2.1 抗原抗體濃度優(yōu)化

包被抗原和抗體濃度是影響檢測方法靈敏度和檢測限的關鍵，參考競爭抑制率與熒光強度對二者進行優(yōu)化。DES包被抗原及抗體濃度優(yōu)化結果見圖1，E2包被抗原及抗體濃度優(yōu)化結果見圖2。

圖1 DES的熒光免疫檢測包被抗原與抗體濃度優(yōu)化結果Fig.1 Optimal concentration of antigen and monoclonal antibody for DES fluorescent immunoassay

如圖1所示，以1∶1 000的比例稀釋DES抗原包被96孔板，1∶2 000的比例稀釋DES抗體捕獲抗原時，兩者濃度配比最佳，方法較為靈敏。

如圖2所示，當包被所用E2抗原濃度為1∶4 000倍稀釋，捕獲抗原的E2抗體為1∶8 000倍稀釋時檢測靈敏度最高。

2.2 二抗?jié)舛葍?yōu)化

將粒徑為100 nm的CdSe/ZnS雜化QDs修飾羊抗小鼠二抗用于檢測方法建立，其光譜圖見圖3。

如圖3所示，修飾二抗的量子點在307 nm處被穩(wěn)定激發(fā)，625 nm處可接收信號。在將要建立的熒光免疫檢測方法中，QDs-Ab2起到至關重要的作用，其濃度直接決定輸出的熒光值大小，需對QDs-Ab2的濃度進行優(yōu)化。QDs-Ab2濃度優(yōu)化結果見表1。

圖2 E2的熒光免疫檢測包被抗原與抗體濃度優(yōu)化結果Fig.2 Optimal concentration of antigen and monoclonal antibody for E2 fluorescent immunoassay

圖3 QDs二抗的熒光光譜圖Fig.3 The fluorescence spectra of QDs-Ab2

表1 不同濃度二抗的雌激素熒光檢測結果Table 1 The fluorescence detection of estrogen with different concentrations of QDs-Ab2

結果表明，在對DES的熒光免疫檢測中，二抗?jié)舛葹?0 μg/mL時所得信噪比最高，熒光響應值也較高。同時對E2檢測的二抗?jié)舛冗M行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)20μg/mL時的檢測信噪比最高，結合經(jīng)濟角度考慮，最終選擇10 μg/mL作為E2檢測的二抗最適濃度。

2.3 緩沖液濃度優(yōu)化

圖4 DES的熒光免疫檢測緩沖液優(yōu)化結果Fig.4 Optimal concentration of buffer for DES fluorescent immunoassay

圖5 E2的熒光免疫檢測緩沖液優(yōu)化結果Fig.5 Optimal concentration of buffer for E2 fluorescent immunoassay

如圖4所示，當緩沖液中甲醇比例為15%時，DES檢測的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）最低，而最大熒光值與IC50的比值最大，表明在該緩沖液濃度下，檢測得到了更高的靈敏度和相對熒光值。

如圖5所示，在對E2做相同優(yōu)化后，得出的最適比例為20%。

2.4 緩沖液pH值優(yōu)化

在對緩沖液中甲醇濃度進行探究后，進一步優(yōu)化緩沖液pH值。在DES檢測中，一定范圍內(nèi)，酸堿度對靈敏度的影響較小，優(yōu)化的最適pH 7.2，優(yōu)化結果見圖6，E2檢測中，緩沖液pH 6.8時得到了較高靈敏度，優(yōu)化結果見圖7。

圖6 DES的熒光免疫檢測pH值優(yōu)化結果Fig.6 Optimal pH for DES fluorescence immunoassay

圖7 E2的熒光免疫檢測pH值優(yōu)化結果Fig.7 Optimal pH for E2 fluorescence immunoassay

2.5 封閉液優(yōu)化

為了驗證封閉液濃度是否會對檢測靈敏度產(chǎn)生影響，分別采用1%、2%、3%的BSA對試驗進行優(yōu)化，DES與E2檢測封閉液優(yōu)化結果分別如圖8、圖9所示，兩種目標物檢測方法最適封閉液濃度均為1%。

圖8 DES的熒光免疫檢測封閉液優(yōu)化結果Fig.8 Optimal sealing fluid concentration for DES fluorescence immunoassay

2.6 標準曲線建立

結合優(yōu)化結果中的最適檢測條件，建立DES熒光免疫檢測標準曲線。結果見圖10。

圖9 E2的熒光免疫檢測封閉液優(yōu)化結果Fig.9 Optimal sealing fluid concentration for E2 fluorescence immunoassay

圖10 DES的熒光免疫檢測標準曲線Fig.10 Standard curve of DES fluorescence immunoassay

如圖10所示，目標物濃度在0.418 ng/mL～195.065 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關系，線性方程為y=18.995-6.434x，線性擬合優(yōu)度R2=0.997，最低檢測限為0.109 ng/mL，IC50為 8.515 ng/mL。

建立E2熒光免疫檢測標準曲線。結果見圖11。

如圖11所示，目標物濃度在0.472 ng/mL～66.597ng/mL內(nèi)呈線性關系，線性方程為y=7.858-3.197x，線性擬合優(yōu)度R2=0.987，最低檢測限為0.236 ng/mL，IC50為 2.865 ng/mL。

2.7 特異性試驗

兩種雌激素熒光免疫檢測特異性試驗結果見表2。

表2 兩種雌激素熒光免疫檢測特異性試驗結果Table 2 The specificity of fluorescence immunoassay for two kinds of estrogen

在特異性試驗中，分別證明了檢測方法對兩種雌激素具有良好選擇性，對類似物交叉反應率較低，可用于復雜樣品的檢測。

2.8 加標回收試驗與方法學比較

兩種雌激素熒光免疫檢測回收率試驗結果見表3。

表3 兩種雌激素熒光免疫檢測回收率試驗結果（n=3）Table 3 Recovery of two kinds of estrogens with fluorescence immunoassay

根據(jù)加標回收試驗結果分析，所建立方法回收率良好，結果穩(wěn)定，表明該方法可用于牛奶實際樣品中DES、E2的檢測。

為評價研究所建立方法與其它方法相比結果是否一致、性能是否存在優(yōu)勢，選擇液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法與本研究所建立方法就檢測限和加標檢測結果進行比較。結果如表4所示。

本研究所建立方法與液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法結果一致，加標樣品均顯示陽性，可用于實際樣品檢測。相比之下，熒光免疫檢測法對于樣品前處理方法要求靈活，無需繁雜程序，在節(jié)省時間的基礎上可降低處理過程對樣品中目標物的損耗。更值得關注的是，免疫熒光檢測不依賴大型儀器，不僅節(jié)約檢測成本，還為實現(xiàn)現(xiàn)場檢測提供了可能。而與傳統(tǒng)ELISA相比，熒光免疫檢測法無需顯色即可直接檢測，不僅縮短了檢測時間，還可免去在過程中使用強酸作為終止液，方法更加綠色安全，具有較高推廣價值。

表4 熒光免疫檢測法與LC-MS/MS方法學比較結果（n=3）Table 4 Fluorescence immunoassay was compared with LC-MS/MS methodology（n=3）

3 結論

分別建立了檢測牛奶中DES、E2殘留的熒光免疫檢測法，得到了較好的回收率和較低交叉反應率，可對實際樣品進行檢測。所建立方法不依靠大型儀器設備和專業(yè)操作，與傳統(tǒng)免疫方法相比檢測時間更短，操作過程綠色安全。具有前處理簡單、安全、快速、靈敏、特異等優(yōu)點，可補充傳統(tǒng)方法，用于牛奶中雌激素獸藥殘留的快速檢測。同時，方法可用于其它小分子污染物在食品中的快速檢測，發(fā)展前景良好。