核磁共振波譜法測定煎炸油的極性組分含量的方法研究

王鳴潔 龍 娟 楊 昊 肖新生 易晶晶

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，永州 425199)

食材在食用油中進(jìn)行高溫煎炸的過程中會發(fā)生美拉德反應(yīng)[1]、褐變反應(yīng)等一系列復(fù)雜的反應(yīng)，形成食品特有的風(fēng)味和色澤，但同時也可能會生成雜環(huán)胺類、揮發(fā)性亞硝胺、苯并芘等有毒的致癌物[2]。而食用油經(jīng)過長時間的高溫加熱，會發(fā)生水解、氧化和聚合等反應(yīng)，產(chǎn)生大量醛、酮、酸、酯和聚合物等組分。高溫煎炸產(chǎn)生的極性組分反映了煎炸油的質(zhì)量劣變水平[3]。傳統(tǒng)評價食用油品質(zhì)的指標(biāo)有極性組分含量、茴香胺值以及羰基值等。我國合格食用植物油的極性組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)為≤27%[4]。

目前，測定食用油極性組分含量的國標(biāo)法為柱層析法，但此法的實施需要大量的樣品、洗脫溶劑和固定相，同時裝柱、過柱、檢測等操作步驟耗時費力，難以實現(xiàn)實時在線監(jiān)測。近來，薛斌等[5]開發(fā)了制備型快速柱層析檢測煎炸油極性組分含量的方法，張紫鶯等[6]開發(fā)了壓電傳感快速檢測煎炸油極性組分含量的方法，檢測效率較國標(biāo)法有明顯提高，但還是存在溶劑耗費量大，樣品量較多或裝置清洗麻煩等問題。故開發(fā)新型快速、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的煎炸油極性組分含量檢測技術(shù)具有重要的意義。核磁共振波譜技術(shù)(簡稱NMR技術(shù))是一種以原子核磁性為基礎(chǔ)的波譜技術(shù)，對于測定化合物的結(jié)構(gòu)具有重要意義[7]。原子核受到外加能量(射頻場)的磁化時，自旋角動量發(fā)生進(jìn)動，當(dāng)外加能量與原子核達(dá)到共振時，原子核吸收能量發(fā)生能級躍遷，并產(chǎn)生共振吸收信號[8]。核磁技術(shù)根據(jù)射頻場頻率的不同分為低場核磁技術(shù)、高場核磁技術(shù)。本研究采用高場NMR技術(shù)，通過核磁共振波譜圖中信號峰的化學(xué)位移推導(dǎo)出化合物的基本結(jié)構(gòu)。

本研究將以菜籽油為煎炸油，投入不同食材進(jìn)行高溫煎炸。使用高場NMR技術(shù)檢測煎炸油樣品的譜圖特征峰相對峰面積，結(jié)合柱層析法測定煎炸油中極性組分含量的結(jié)果，建立NMR技術(shù)測定的煎炸油特征峰相對峰面積與柱層析法測定的煎炸油的極性組分含量之間的曲線關(guān)系。通過重復(fù)性實驗與顯著性差異分析實驗驗證NMR技術(shù)測定煎炸油的極性組分含量方法的適用性，為煎炸油中極性組分含量快速檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV2800紫外可見分光光度計,HS-7恒溫磁力加熱攪拌器,Bruker Avance III HD 400核磁共振波譜儀,TD-2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,R-1001UN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,SHB-Ⅲ臺式循環(huán)水真空泵,菜籽油(國標(biāo)一級)，新鮮熟饅頭、無芽土豆、雞胸肉、草魚肉，分析純氘代氯仿、乙醚、石油醚、乙酸乙酯。

1.2 實驗方法

1.2.1 煎炸食材的前處理

選擇新鮮無腐敗的熟饅頭、無芽土豆、雞胸肉、草魚肉作煎炸食材，仔細(xì)清洗后瀝干表面水分，分別切成大小相等的長條狀(3 cm×1 cm×1 cm)備用[9]。

1.2.2 煎炸油的制備

量取四份菜籽油各150 mL分別置于四個恒溫磁力加熱攪拌器中，各加熱器均控制溫度在(160±3) ℃加熱。稱取四種煎炸食材各100 g分別置于四個恒溫磁力加熱攪拌器中進(jìn)行煎炸，每個加熱器中放置一種食材。每連續(xù)煎炸30 min，停止加熱 5 min，停止加熱期間向恒溫磁力加熱攪拌器中放置相同質(zhì)量和種類的煎炸食材。每天同時煎炸8 h，重復(fù)連續(xù)煎炸6 d，在煎炸過程中一旦食材炸至金黃立即撈出[10]。煎炸前16 h(即前2 d)，每隔2 h用玻璃吸量管取一次油樣置于潔凈塑料離心管中[11]。煎炸第16～48 h(即后4 d)，每隔1 h取一次油樣。樣品冷卻后，置于4 ℃的冰箱中儲存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 NMR法檢測樣品及分析數(shù)據(jù)的方法

將1.2.2中收集的煎炸油樣品分別取0.04 mL于直徑為5 mm的干燥潔凈核磁管中，各加入0.5 mL氘代氯仿試劑，混合溶解均勻后待測。利用Bruker Avance III HD 400核磁共振波譜儀檢測各個煎炸油樣品的核磁共振信號，選擇氫譜掃描16次，以核磁共振波譜儀采集樣品的氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行積分[13]。使用MestReNova軟件對上一步得到的氫譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將測得樣品的核磁共振信號原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova，找到氫譜特征峰，對其中一個特征峰積分并計算峰面積，再以該峰的積分為基準(zhǔn)對圖譜中其他特征峰進(jìn)行分段積分，積分后得到各個峰的峰面積[11]，再綜合研究各譜圖間特征峰的變化規(guī)律[14]。

1.2.4 柱層析法測定煎炸油中極性組分含量

采用柱層析法(具體操作參照國標(biāo)中第二法[15])測定煎炸油中極性組分含量。

1.2.5 NMR技術(shù)測定煎炸油中極性組分含量

1.2.5.1 煎炸油的相對峰面積與極性組分含量之間相關(guān)性的建立

選取(160±3) ℃下高溫煎炸土豆0 、6 、10 、14 、16 h時的煎炸油樣品各一份，用NMR技術(shù)分別檢測每份煎炸油樣品，得到每份樣品各自的核磁譜圖，分析尋找特征峰，積分得到特征峰的相對峰面積，然后以特征峰的相對峰面積為橫坐標(biāo)，極性組分含量為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立煎炸油的相對峰面積與極性組分含量之間相關(guān)性。

1.2.5.2 NMR技術(shù)和柱層析法分別檢測煎炸油極性組分的重復(fù)性實驗[16]

選取1.2.2中第10 h煎炸饅頭、雞胸肉、魚、土豆的4種煎炸油樣品各一份，各樣品用NMR技術(shù)和柱層析法分別檢測，對這4種煎炸油樣品進(jìn)行8組平行檢測。以Bruker Avance Ⅲ HD400核磁共振波譜儀檢測得到各樣品的氫譜圖，得到的圖譜采用MestReNova軟件進(jìn)行處理分析，將處理所得樣品煎炸油的特征峰相對峰面積代入已建立的NMR技術(shù)測定極性組分含量方法的線性方程中計算出煎炸油的極性組分含量，并根據(jù)計算出的煎炸油的極性組分的含量結(jié)果按如下公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差σ和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Vσ。采用同樣方法，將柱層析法檢測所得煎炸油極性組分含量的結(jié)果代入以下公式中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算，最后將兩種方法檢測及計算得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行比較。

1.2.5.3 NMR技術(shù)和柱層析法分別測定煎炸油樣品極性組分含量的顯著性分析實驗

選取1.2.2中的(160±3) ℃下第8 h煎炸土豆的煎炸油樣品，將此油樣用NMR技術(shù)和柱層析法分別檢測。利用Bruker Avance Ⅲ HD400核磁共振波譜儀檢測，得到樣品的氫譜圖，并使用MestReNova軟件分析所得圖譜的特征峰相對峰面積，將該特征峰相對峰面積代入已建立的NMR技術(shù)測定的煎炸油中極性組分含量的標(biāo)曲方程中得到對應(yīng)的煎炸油樣品的極性組分的含量結(jié)果。同樣地，將柱層析法檢測所得的煎炸油極性組分含量的結(jié)果代入已建立的NMR技術(shù)測定的煎炸油中極性組分含量的標(biāo)曲方程中，得到對應(yīng)的煎炸油樣品的極性組分的含量結(jié)果。利用Excel工具將二法所得油樣的極性組分含量結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 煎炸油的特征峰相對峰面積與極性組分含量之間的關(guān)系分析

選擇δ 4.20～4.07范圍對應(yīng)甘油基中的亞甲基基團(tuán)的相對峰面積為基準(zhǔn)并設(shè)為10，對δ 2.9～2.7進(jìn)行積分處理分析，如圖1、圖2所示，在δ 2.9～2.7范圍之間的基團(tuán)主要是亞油酸甘油酯中2個烯鍵之間的亞甲基和亞麻酸甘油酯中3個烯鍵之間的亞甲基[17]。食用油在高溫加熱過程中，多不飽和脂肪酸雙鍵之間的亞甲基容易氧化形成氫過氧化物，進(jìn)一步分解產(chǎn)生醛、酮、酸和醇類等極性化合物。極性組分的含量隨烯鍵之間亞甲基的減少而上升。研究中以核磁共振氫譜中甘油骨架上亞甲基的峰面積為基準(zhǔn)(該兩個氫加熱過程中相對穩(wěn)定，本研究將其峰面積定為10)，積分出δ 2.9～2.7范圍之間峰的相對面積。

圖1 (160±3) ℃的第6 h的煎炸油的1H NMR譜

圖2 (160±3) ℃煎炸油隨煎炸時間變化的1H NMR譜

選取(160±3) ℃溫度下煎炸土豆第0 、6 、10 、14 、16小時的煎炸油樣品分別采用NMR技術(shù)與柱層析法進(jìn)行測定，并建立煎炸油的特征峰(亞油酸酯中2個烯鍵之間的亞甲基和亞麻酸甘油酯中3個烯鍵之間的亞甲基的氫譜峰)相對峰面積與極性組分含量之間的關(guān)系。1H NMR譜圖進(jìn)行歸一化處理后表明在δ 2.9～2.7的特征峰的相對峰面積有下降的趨勢，結(jié)果見圖3。

由圖3可看出隨著煎炸時間的延長，煎炸油的特征峰相對峰面積呈下降的趨勢，煎炸油的極性組分含量逐漸增加。δ 2.9～2.7處為碳碳雙鍵后第一個碳上的氫原子，亞油酸、亞麻酸在此處有吸收峰，菜籽油經(jīng)過高溫煎炸會發(fā)生氧化、水解、聚合等一系列復(fù)雜的化學(xué)變化[1]，在此過程中油脂的雙鍵會不斷地減少，有毒物質(zhì)也不斷生成，易揮發(fā)和難揮發(fā)的極性組分也會不斷的產(chǎn)生。因此菜籽油在高溫煎炸的過程中，煎炸油的特征峰相對峰面積會逐漸小于未煎炸的菜籽油，極性組分含量也會隨煎炸時間的延長不斷增加。

圖3 煎炸油的特征峰相對峰面積與極性組分 含量隨煎炸時間的變化曲線

接下來以NMR技術(shù)測定的煎炸油的特征峰相對峰面積數(shù)據(jù)為橫坐標(biāo)，以柱層析法測定的煎炸油中的極性組分含量為縱坐標(biāo)，繪制極性組分含量與特征峰面積之間的關(guān)系曲線。通過線性回歸分析可知，煎炸油的相對峰面積與極性組分含量之間的曲線關(guān)系是y=-8.327 6x+90.215，相關(guān)系數(shù)R2=0.977 3，說明煎炸油特征峰相對峰面積與極性組分之間有良好的線性相關(guān)性，可采用NMR 技術(shù)檢測煎炸油的極性組分含量。

2.2 NMR技術(shù)測定煎炸油中極性組分含量的重復(fù)性分析

選取(160±3) ℃下的第10小時的饅頭、雞胸肉、魚、土豆4種煎炸油樣品各一份，每份樣品都使用NMR技術(shù)與柱層析法分別檢測，對這4個煎炸油樣品做8組平行實驗。將NMR技術(shù)測定煎炸油樣品的特征峰相對峰面積檢測的結(jié)果代入y=-8.327 6x+90.215得到煎炸油樣品的極性組分含量并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算。同樣地將柱層析法測定的煎炸油極性組分含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對偏差的計算，再將二者進(jìn)行比較，結(jié)果見表1、表2。

表1是使用柱層析法測定8組平行的煎炸油極性組分含量的結(jié)果，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.19%～1.68%。

表1 柱層析法測定的煎炸油的極性組分含量

表2 NMR技術(shù)檢測煎炸油極性組分含量的結(jié)果

由表2可看出NMR技術(shù)檢測的8組平行的煎炸油極性組分含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.72%～2.53%，相較于柱層析法檢測所得結(jié)果，NMR技術(shù)檢測的8組平行的煎炸油極性組分含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍略大，但仍小于5%，表明NMR技術(shù)檢測煎炸油的極性組分含量實驗有較好的重復(fù)性。

2.3 NMR技術(shù)與柱層析法檢測的顯著性差異分析

實驗首先選取(160±3) ℃下煎炸土豆8 h的煎炸油樣品，作為中等極性組分含量的樣品的代表。用柱層析法和NMR技術(shù)先后對煎炸油樣品的極性組分含量進(jìn)行8組平行檢測，然后對柱層析法和NMR技術(shù)檢測煎炸油樣品的極性組分含量的結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析，并比較二法之間的差異性。測定結(jié)果如表3所示。

表3 NMR技術(shù)與柱層析法測定煎炸8 h煎炸油的極性組分含量

由表3看出，兩種檢測煎炸油極性組分含量的方法平均值相近，NMR技術(shù)檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較柱層析法的稍大。利用Excel對這兩種方法進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表4所示。由表4中單因素方差分析結(jié)果可知，P=0.601>0.05，F(xiàn)=0.29

表4 煎炸8 h煎炸油兩種方法測定結(jié)果的單因素方差分析

實驗接著選取(160±3) ℃下煎炸土豆16 h的煎炸油樣品，作為高極性組分含量的樣品的代表，然后分別采用柱層析法和NMR技術(shù)對煎炸油樣品進(jìn)行8次平行測定。測定結(jié)果如表5所示。

表5 NMR技術(shù)與柱層析法測定煎炸16 h的煎炸油的極性組分含量

對表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表6所示。由表6中單因素方差分析結(jié)果可知，P=0.839>0.05，F(xiàn)=0.043 1

表6 煎炸8h煎炸油兩種方法測定結(jié)果的單因素方差分析

3 結(jié)論

通過本研究對8組煎炸油樣品的極性組分含量的測定，實驗得出采用NMR技術(shù)測定煎炸油的特征峰相對峰面積與極性組分含量之間的線性回歸方程為y=-8.327 6x+90.215，確證了隨著煎炸時間的延長，煎炸油中極性組分含量將逐漸增加；對于同樣的煎炸油樣品，分別采用NMR技術(shù)和柱層析法檢測煎炸油中極性組分的含量，并進(jìn)行重復(fù)性實驗和顯著性差異分析，對比實驗結(jié)果表明了二法檢測所得效果無顯著差異。本研究證明了NMR技術(shù)測定煎炸油中極性組分含量方法的可重復(fù)性及便捷性，同時驗證了NMR技術(shù)測定煎炸油的極性組分含量的方法的適用性。使用NMR技術(shù)替代柱層析法檢測煎炸油中極性組分含量，這有助于實時對煎炸油的品質(zhì)劣變程度進(jìn)行監(jiān)控并評價?？傊琋MR技術(shù)的高效性、準(zhǔn)確性、簡便性有助于大量糧樣品中極性成分的精確測定。