李靜雅 白 瑩 薛林科 張小林
(甘肅醫(yī)學(xué)院,平?jīng)?744000)
油脂是日常飲食三大產(chǎn)能營養(yǎng)素之一[1],過氧化值反映了油脂變質(zhì)程度[2]。目前過氧化值的檢測方法很多,主要有碘量法[3-6]、光度法[7-8],紅外光譜法[9]、色譜法[10]、電化學(xué)分析法[11]等。碘量法采用氧化-還原滴定法,是油脂過氧化值國標(biāo)通用分析方法[12],受溶液pH值、溫度、加水量及搖動(dòng)速度、滴定終點(diǎn)判斷等諸多因素影響,使得測定值波動(dòng)性大,重復(fù)性差;同時(shí),該法取樣量大,僅適用于含0.4 mmol/kg以上過氧化物的測定,靈敏度低,很難做到微量分析。熒光光譜技術(shù)因其靈敏度高,選擇性強(qiáng),試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)被關(guān)注,Santas等[12]以二苯基-1-芘基膦試劑為熒光探針,完成食用油脂過氧化值熒光光譜檢測,測定了43個(gè)樣品的過氧化值(0~15 mmol/kg);Guzmán等[13]利用熒光光譜結(jié)合多變量分析技術(shù)研究了橄欖油的各種質(zhì)量參數(shù),為測定油脂的過氧化值提供了又一個(gè)有效的方法。
羅丹明B(Rhodamine B,RhB)俗稱花粉紅,是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料,稀釋液有強(qiáng)烈熒光,可溶性碘(I3-)與其有締合反應(yīng)[14-16]。油脂中過氧化物與過量碘化鉀(I-)反應(yīng)生成水溶性碘(I3-),締合反應(yīng)使其熒光猝滅,熒光猝滅程度取決于油脂中過氧化物含量。本實(shí)驗(yàn)研究了有過氧化物存在時(shí)KI-RhB體系的熒光光譜特性,提出了用羅丹明B染料熒光猝滅法測定油脂過氧化值的新方法。羅丹明B熒光猝滅法簡便快捷,靈敏度高,過氧化物最低檢出量達(dá)到0.06 mmol/kg,更適合于油脂過氧化值微量分析。通過油脂空白試驗(yàn),有效克服了共存還原性物質(zhì)及有機(jī)溶劑的干擾,測定過程不受樣品濁度和色度影響,方法的選擇性進(jìn)一步提高。
930N熒光分光光度計(jì)。
30%H2O2、羅丹明B、醋酸、醋酸鈉、冰醋酸、碘化鉀、三氯甲烷:分析純。
H2O2對(duì)照液:取25 mL的30%H2O2稀釋成250 mL,KMnO4標(biāo)定,根據(jù)標(biāo)定值二次稀釋為1 mmol/L;羅丹明B溶液∶1.0×10-4mol/L;飽和碘化鉀溶液:稱取14 g碘化鉀,加10 mL水溶解;三氯甲烷-冰乙酸混合液(2∶3),混勻;0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.5)。食用植物油作分析樣品,均來自當(dāng)?shù)爻小?/p>
油脂中的過氧化物與碘化鉀定量反應(yīng)生成碘單質(zhì)(I2)
ROOH(過氧化物)+2HI→H2O+I2+ROH
過量碘化鉀作助溶劑形成可溶性碘(I3-):
I2+I-=I3-
在弱酸環(huán)境下,I3-與羅丹明B陽離子通過靜電引力形成締合物,締合反應(yīng)導(dǎo)致羅丹明B熒光猝滅,猝滅程度決定過氧化物含量。
1.4.1 樣液制備
稱取3~5 g油脂樣品(精確到0.000 1 g)于25 mL容量瓶,用三氯甲烷-冰乙酸混合溶劑(2∶3)溶解并稀釋定容,取樣前再次充分振蕩。
1.4.2 樣品測定
準(zhǔn)確移取100 μL樣液于50 mL容量瓶中,加飽和KI溶液1.0 mL,充分振蕩后靜置反應(yīng)25 min,加1.00×10-4mol/L羅丹明B 4.00 mL,0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)5.00 mL,蒸餾水定容,靜置20 min,以365 nm作激發(fā)波長,580 nm作發(fā)射波長,1.0×10-6mol/L羅丹明B作為靈敏度調(diào)試液,測定熒光強(qiáng)度F。同時(shí)完成油脂空白試驗(yàn)(不加KI)F0測定,根據(jù)熒光猝滅程度ΔF(ΔF=F0-F)確定油脂過氧化值。
注:X為過氧化值/mmol/kg;k為方程斜率(k=7 598L/mmol);m為油脂樣品質(zhì)量/g。
1.4.3 過程比較
碘量法與熒光猝滅法過程比較見表1。
表1 兩種方法測定過程比較
當(dāng)λex=365 nm時(shí),羅丹明B在580 nm處有一最大熒光峰(圖1曲線1),加入過量KI時(shí),羅丹明B熒光值不受影響,加入H2O2后,I-被氧化為I3-,羅丹明B與I3-締合反應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅,熒光強(qiáng)度迅速下降(圖1曲線2);熒光猝滅程度隨H2O2濃度增大而增強(qiáng)(圖1曲線3)。
注:1.RhB+I-,2.RhB+I-+H2O2(0.005mmol/L),3.RhB+I-+H2O2(0.018mmol/L)。圖1 不同體系的熒光光譜
取1 mmol/L H2O2對(duì)照液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,再分別加入0.10 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液,以此代替油脂樣品,按方法完成F和F0測定,計(jì)算ΔF,以濃度c(mmol/L)為橫坐標(biāo),ΔF為縱坐標(biāo),繪制H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線,構(gòu)建油脂過氧化值模型方程。結(jié)果表明,在0.000~0.024 mmol/L范圍內(nèi),H2O2濃度c與熒光強(qiáng)度變化值ΔF有良好的線性關(guān)系:ΔF=7 598c-0.892 7,r=0.998 9,按實(shí)驗(yàn)方法平行測定H2O2空白11次,標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.012,3倍的信噪比求得過氧化氫檢測限為4.74×10-6mmol/L,當(dāng)取0.02 g油樣稀釋時(shí),得出油脂過氧化值最低檢出量為0.06 mmol/kg。試驗(yàn)選擇以365 nm作為激發(fā)波長,檢測580 nm發(fā)射波長處溶液的熒光強(qiáng)度。
在pH 4.5環(huán)境下考察不同體積羅丹明B溶液的熒光特性。結(jié)果表明,在0~4 mL范圍內(nèi)羅丹明B稀釋液熒光強(qiáng)度與1.0×10-4mol/L羅丹明B加入體積有線性關(guān)系,當(dāng)稀釋液中c(RhB)≥8.0×10-6mol/L時(shí),V(RhB)>4mL,熒光強(qiáng)度趨于恒定,羅丹明B分子間發(fā)生了聚合[18]。故1.0×10-4mol/L羅丹明B取量確定為4.00 mL。
取1 mmol/L H2O22.00 mL,用0.1 mol/L鹽酸改變反應(yīng)體系pH值,測定pH2~6范圍內(nèi)“H2O2+I-+RhB”體系熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明,pH=4.0~5.0時(shí),猝滅程度最大,熒光強(qiáng)度達(dá)到最低。H2O2是含氧型氧化劑,半反應(yīng)有H+參與,但酸度過高時(shí),部分H2O2發(fā)生分解。故實(shí)驗(yàn)選用pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作反應(yīng)介質(zhì)。
KI有雙重功效,既是還原劑,又是助溶劑,為促進(jìn)碘合離子(I3-)形成,加大羅丹明B熒光猝滅程度;碘化鉀加入量過少會(huì)使反應(yīng)不充分,測定結(jié)果偏小,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性;過多則會(huì)因碘化鉀空氣氧化產(chǎn)生誤差。取1 mmol/L H2O2對(duì)照液2.00 mL,其他條件不變,僅改變飽和碘化鉀溶液加入量,按“1.4”測定方法完成F測定。結(jié)果表明,當(dāng)飽和碘化鉀的添加量超過0.4 mL后,即使碘化鉀的添加量增加,溶液的熒光強(qiáng)度依然趨向穩(wěn)定值,說明此時(shí)碘化鉀的添加量已經(jīng)能夠滿足反應(yīng)需求,因此確定飽和碘化鉀的添加量為0.5 mL。
碘化鉀與油樣中過氧化物的反應(yīng)時(shí)間決定了油樣中過氧化物能否完全反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間過長或過短都可在一定程度上影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取1 mmol/L H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL,其他條件不變,僅改變加入碘化鉀后的靜置反應(yīng)時(shí)間,按“1.4”測定方法完成F測定,不同反應(yīng)時(shí)間的溶液熒光強(qiáng)度變化情況如圖2所示。
圖2 氧化反應(yīng)時(shí)間影響
過氧化物與碘化鉀混合時(shí)間直接決定了熒光猝滅程度,反應(yīng)進(jìn)行25 min后,溶液熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間變化不大,趨近一個(gè)穩(wěn)定值,說明此時(shí)過氧化物已經(jīng)和碘化鉀反應(yīng)較為充分,繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間也不能使溶液熒光強(qiáng)度有較大的變化,因此反應(yīng)時(shí)間定為25 min。
實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察締合反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響(圖3)。結(jié)果表明,加入羅丹明B后,熒光強(qiáng)度隨靜置時(shí)間延長而減小,20 min后熒光強(qiáng)度趨于恒定。故加羅丹明B后靜置時(shí)間確定為20 min。
圖3 熒光猝滅反應(yīng)時(shí)間影響
取不同植物油樣品,按“1.4”方法完成過氧化值測定,并與碘量法作比較,測定結(jié)果見表2。
表2 樣品分析結(jié)果(n=6)
利用所建方法對(duì)不同待測油樣過氧化值進(jìn)行了6次平行測定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)控制在2.8%范圍內(nèi),測定結(jié)果與碘量法基本一致,測量誤差小于5%。
本實(shí)驗(yàn)基于“H2O2-I--RhB”反應(yīng)體系建立了油脂過氧化值檢測模型,油脂加入前后熒光強(qiáng)度變化量(ΔF)體現(xiàn)了油脂過氧化值,方法簡單且具有很好的靈敏度,用于油脂過氧化值微量檢測,最低檢出量為0.06 mmol/kg;碘化鉀空白實(shí)驗(yàn)有效克服有機(jī)溶劑及油脂中共存還原性物質(zhì)干擾。