濕法糖基化處理大豆11S蛋白后的表面活性變化

杜沁嶺 周思懿 吳岱澤 張效銘 王 珮 楊文鈺 張 清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，雅安 625014) (四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心2，成都 611130)

大豆11S蛋白是大豆蛋白的主要儲(chǔ)藏蛋白之一，約占大豆蛋白總量的31%[1]，與大豆蛋白的功能性質(zhì)密切相關(guān)[2]。大豆11S蛋白具有水合性質(zhì)、乳化性、持水持油性等表面活性，同時(shí)還具有可降解性，是一種環(huán)境友好的天然可再生資源。然而，由于提取的大豆 11S 蛋白具有緊密的分子結(jié)構(gòu)，多數(shù)基團(tuán)被包裹在分子內(nèi)部，導(dǎo)致其本身表面活性較差，在食品中的應(yīng)用受到限制[3]。所以，為了改良大豆11S蛋白的表面活性，需要對(duì)其進(jìn)行改性處理。

糖基化改性具有反應(yīng)過(guò)程溫和、改性蛋白性質(zhì)穩(wěn)定和無(wú)有毒有害試劑添加等優(yōu)點(diǎn)，常被選為大豆蛋白的理想改性方法[4]。大豆蛋白的糖基化改性已有廣泛研究，潘男等[5]、Lu等[6]和Seo等[7]分別研究了大豆蛋白與不同種類多糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后凝膠性、溶解性、乳化性等功能性質(zhì)的改善情況。另外，前人也對(duì)大豆11S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性[8]、熱處理凝膠性[9]進(jìn)行了研究。而對(duì)于大豆11S蛋白與多糖發(fā)生糖基化反應(yīng)改性后表面活性變化的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以3種不同分子質(zhì)量大小(4、10、70 ku)的葡聚糖對(duì)大豆11S蛋白進(jìn)行濕法糖基化反應(yīng)，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和熒光光譜測(cè)定其反應(yīng)發(fā)生程度，對(duì)大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的表面疏水性、Zeta電位、溶解性(不同pH條件下)、乳化性、持水持油性進(jìn)行測(cè)定，從結(jié)構(gòu)特征和功能性質(zhì)兩方面分析糖基化反應(yīng)后表面活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(合豐57)，葡聚糖(4、10、70 ku)；Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒，8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，大豆油，其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)(CS-700)，臺(tái)式恒溫振蕩器(150638)，高速剪切均質(zhì)機(jī)(AD500S-H)，冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50)，冷凍離心機(jī)(Micro17)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-6)，熒光分光光度計(jì)(Thermo scientific R)，Zeta電位儀(Nano ZS)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆11S蛋白的提取

大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎1 min過(guò)80目篩后置于錐形瓶中，與乙醚(1∶8)混勻后振蕩4 h(25 ℃，110 r/min)；靜置15 min，待料液分層后棄去上層溶劑，將下層脫脂大豆粉置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干[9]后分散在0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液中(1∶10)，在45 ℃、pH 8.5的條件下磁力攪拌1 h后離心(4 ℃，8 500 r/min，20 min)。向上清液中加入NaHSO3使其濃度為0.01 mol/L，調(diào)節(jié)pH至6.4；于4 ℃冰箱過(guò)夜后再離心(4 ℃，6 500 r/min，20 min)，沉淀部分即為11S蛋白[10]。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)提取樣品進(jìn)行鑒定。

1.3.2 大豆11S蛋白濕法糖基化處理

將大豆11S蛋白配成5 mg/mL的蛋白溶液，再加入等質(zhì)量的葡聚糖，混勻后密封放置在80℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行糖基化反應(yīng)，分別反應(yīng)1、2、3、4、5 h后取出樣品，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，得到大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物。將樣品冷凍干燥后置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SDS-PAGE測(cè)定

分離膠、濃縮膠濃度分別為13%、5%，樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL，上樣量為10 μL，凝膠電泳于恒定電壓下進(jìn)行(120 V)。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色完成后，對(duì)凝膠拍照并進(jìn)行分析[11]。

1.3.4 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

樣品分散在10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)中，濃度為0.15 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm(狹縫寬度5 nm)，以20 nm/s的速率在300～510 nm內(nèi)掃描，測(cè)定熒光強(qiáng)度[12]。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

將糖基化蛋白樣品分散于蒸餾水中制成蛋白濃度1 mg/mL的溶液，充分?jǐn)嚢韬箅x心(4 ℃，10 220r/min，20 min)，取上清液4 mL，加入8 mmol/L的ANS溶液40 μL，充分振蕩混勻后靜置3 min，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度(FI)。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm(狹縫寬度5 nm)，以20 nm/s的速率在400～600 nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定熒光強(qiáng)度。以掃描范圍內(nèi)最大熒光強(qiáng)度值作為蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)[13]。

1.3.6 Zeta電位測(cè)定

配制0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，脫氣后，再加入糖基化產(chǎn)物充分溶解至蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，測(cè)定zeta電位，測(cè)定溫度為25 ℃，重復(fù)測(cè)定3次以上，取平均值[14]。

1.3.7 不同pH條件下溶解性測(cè)定

將10 mg糖基化蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，混勻后用0.05 mol/L乙酸溶液、0.05 mol/L磷酸鹽溶液、0.05 mol/L Tris溶液分別調(diào)節(jié)溶液pH至pH=3、4和5；pH=6、7和8；pH=9。配置好后離心(4 ℃，10 220 r/min，20 min)，采用Lowry法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，以0.5 mg/mL牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=47.509x+0.066 1，R2=0.998 2)。蛋白質(zhì)溶解度表示為上清液中蛋白質(zhì)量與樣品中總蛋白質(zhì)量的比值[15]。

(1)

式中：m1為上清液中蛋白質(zhì)量；m0為樣品中總蛋白質(zhì)量。

1.3.8 乳化活性(EA)及乳化穩(wěn)定性(ES)測(cè)定

將糖基化蛋白樣品分散于pH=6.5、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中制成蛋白濃度為1 mg/mL溶液，按體積比4∶1加入大豆油，于2 000 r/min下高速勻漿1 min，立即或10 min后從距燒杯底部0.5 cm處取勻漿液100 μL加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中，振蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A0或A10。以0.1%的SDS溶液作空白對(duì)照。蛋白溶液的EA和ES，分別用式(2)、式(3)計(jì)算[16]。

(2)

(3)

式中：c為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/g/mL；φ為油相所占體積分?jǐn)?shù)(φ=0.25)；A10為靜置10 min時(shí)乳狀液的吸光值；A0為靜置0 min時(shí)乳狀液的吸光值。

1.3.9 持水性(WRC)及持油性(ORC)測(cè)定

將50 mg(m0)糖基化蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，室溫下水合18 h后離心(4 ℃，10 000r/min，20 min)，棄去上清液，記錄沉淀質(zhì)量m1，再將沉淀在60 ℃下干燥至恒重，記錄質(zhì)量m2。在相同操作步驟下，用大豆油代替蒸餾水即為持油性測(cè)定方法。按照式(4)計(jì)算 WRC或ORC[17]。

(4)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)；采用差異顯著性分析處理數(shù)據(jù)，并由SPSS V17.0軟件完成，P<0.05為顯著性差異；采用Origin9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆11S蛋白濕法糖基化反應(yīng)程度分析

2.1.1 SDS-PAGE電泳圖譜分析

如圖1所示，與marker相比，泳道1中11S蛋白條帶顏色明顯，其余條帶顏色較淺，有少量雜蛋白殘余。目前鮮見(jiàn)研究能提取出純凈的11S蛋白，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)從大豆蛋白中提取出的11S蛋白可作為樣品使用。對(duì)比泳道1～6，大豆11S蛋白與不同分子質(zhì)量葡聚糖在發(fā)生糖基化反應(yīng)后，酸性和堿性亞基條帶顏色隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變淺，4 h最淺?？捡R斯亮蘭作為染料常與蛋白質(zhì)中的自由氨基結(jié)合而呈現(xiàn)顏色，因此條帶顏色變淺可以間接證明自由氨基減少[18]，這表明大豆11S蛋白的氨基與葡聚糖的羰基發(fā)生共價(jià)結(jié)合即發(fā)生了糖基化反應(yīng)且在4 h時(shí)反應(yīng)程度最大。泳道2～6在分離膠頂部出現(xiàn)新的化合物條帶，這是因?yàn)樘腔磻?yīng)生成了大分子聚合物，即為蛋白-多糖軛合物，由于其分子質(zhì)量較大，不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)而堆積在凝膠頂部。因此本實(shí)驗(yàn)中大豆11S蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)并產(chǎn)生了大分子物質(zhì)。該結(jié)果與章鼎敏等[19]的分析相似。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白；1為大豆11S蛋白；2～6分別代表反應(yīng)1、2、3、4、5 h大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物。圖1 大豆11S蛋白分別與4、10、70 ku 葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)電泳圖

2.1.2 熒光光譜分析

熒光光譜技術(shù)的應(yīng)用能夠較為靈敏的反應(yīng)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。如圖2所示，大豆11S蛋白與不同分子質(zhì)量葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后生成軛合物的最大熒光強(qiáng)度值與未處理的大豆11S蛋白相比發(fā)生了不同程度的下降，說(shuō)明糖基化反應(yīng)影響了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。葡聚糖多糖鏈與蛋白質(zhì)的色氨酸殘基結(jié)合后，對(duì)色氨酸殘基產(chǎn)生屏蔽作用，其被包圍在疏水環(huán)境中使蛋白具有更加緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]，從而導(dǎo)致軛合物最大熒光強(qiáng)度的不斷下降。如圖2a和圖2b，大豆11S蛋白與4、10 ku葡聚糖反應(yīng)后最大熒光強(qiáng)度值在4 h最低；如圖2c，大豆11S蛋白與70 ku葡聚糖反應(yīng)后最大熒光強(qiáng)度值在3 h最低，這說(shuō)明反應(yīng)3～4 h時(shí)對(duì)色氨酸的屏蔽作用最強(qiáng)。但在糖基化反應(yīng)后期4～5 h時(shí)，最大熒光強(qiáng)度卻出現(xiàn)上升狀態(tài)，這可能是因?yàn)槠暇厶桥c大豆11S蛋白的進(jìn)一步緊密結(jié)合，蛋白質(zhì)色氨酸殘基之間相互接近其芳香族部位通過(guò)疏水相互作用形成復(fù)合物，這種復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致最大熒光強(qiáng)度的峰值再次上升[20]。熒光光譜圖中最大熒光強(qiáng)度的變化證明了大豆11S蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)且該反應(yīng)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成一定影響。

圖2 大豆11S蛋白分別與4、7、10 ku 葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后熒光強(qiáng)度變化

2.2 大豆11S蛋白濕法糖基化反應(yīng)后蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)表面疏水性的強(qiáng)弱與蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)的變化情況密切相關(guān)，通過(guò)分析表面疏水性變化可以反映糖基化反應(yīng)后蛋白結(jié)構(gòu)的變化[21]。如圖3，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物表面疏水性低于改性前，并隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后降低的輕微波動(dòng)趨勢(shì)。該波動(dòng)趨勢(shì)可能受兩方面因素影響，一方面由于蛋白質(zhì)與葡聚糖結(jié)合后，葡聚糖相應(yīng)的糖鏈部分可能會(huì)包裹或覆蓋位于蛋白質(zhì)外層疏水性基團(tuán)，多糖鏈的遮蔽作用使熒光探針難以與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)結(jié)合[12]，從而使得疏水性下降；另一方面隨著糖基化反應(yīng)程度加深，和蛋白質(zhì)結(jié)合的葡聚糖也會(huì)攜帶部分疏水基團(tuán)，并隨著糖基化反應(yīng)遷移到蛋白表面[22]，從而提高疏水性。兩方面因素的共同作用使得糖基化反應(yīng)后疏水性發(fā)生不同程度的改變，但是總體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。通過(guò)比較不同分子質(zhì)量軛合物表面疏水性變化趨勢(shì)及峰值點(diǎn)，低分子質(zhì)量葡聚糖(4、10 ku)糖基化反應(yīng)程度最大，表面疏水性下降最明顯。

注：不同大小寫(xiě)字母，標(biāo)“*”字母分別表示大豆11S蛋白～4 ku葡聚糖軛合物、大豆11S蛋白～10 ku葡聚糖軛合物、大豆11S蛋白～70 ku葡聚糖軛合物之間的顯著性差異(P<0.05)。余同。圖3 大豆11S蛋白糖基化反應(yīng)后表面疏水性變化

2.2.2 Zeta電位分析

Zeta電位是表征溶液膠體穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)帶電荷情況的重要參數(shù)。如圖4，在中性條件下，大豆11S蛋白和大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物Zeta電位值均為負(fù)值，且軛合物Zeta電位絕對(duì)值大部分低于改性前，大豆11S蛋白表面有帶負(fù)電荷的羧基基團(tuán)，葡聚糖不帶電荷，二者結(jié)合后仍帶負(fù)電。同時(shí)，葡聚糖親水性糖鏈與大豆11S蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合后，對(duì)蛋白質(zhì)表面電荷產(chǎn)生屏蔽作用[23]，導(dǎo)致Zeta電位絕對(duì)值下降。溶液中單個(gè)軛合物分子和可溶性的蛋白大粒徑聚集物同時(shí)存在，可能是Zeta電位呈現(xiàn)出波動(dòng)變化的原因[24]。Zeta電位與表面疏水性變化趨勢(shì)相似，與齊寶坤等[14]的研究結(jié)果一致。軛合物Zeta電位絕對(duì)值下降可能受到蛋白質(zhì)和多糖種類的影響[25]，大豆11S蛋白含有較多的含硫氨基酸，凝膠性好且結(jié)構(gòu)不易被破壞[26]；葡聚糖的存在能夠更好地保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)，使得蛋白處于一種相對(duì)緊湊的狀態(tài)[27]，兩方面因素可能導(dǎo)致蛋白表面帶電基團(tuán)被遮蔽，內(nèi)部帶電基團(tuán)不易暴露，Zeta電位下降。

圖4 大豆11S蛋白糖基化反應(yīng)后Zata電位變化

2.3 大豆11S蛋白濕法糖基化反應(yīng)后理化性質(zhì)分析

2.3.1 不同pH條件下溶解性分析

圖5為反應(yīng)4 h后溶解度的變化，其余反應(yīng)時(shí)間的變化與之相似。在不同的反應(yīng)時(shí)間條件下，在pH 3～9的范圍內(nèi)，大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的溶解度隨著pH的增加表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)，在pH=5時(shí)，溶解度最小。在所有反應(yīng)時(shí)間下，大豆11S蛋白與不同分子質(zhì)量的葡聚糖結(jié)合后生成的軛合物的溶解度均表現(xiàn)出不同程度的降低，且隨著分子質(zhì)量增大，溶解度降低程度增加，這可能是由于糖基化反應(yīng)程度加深，親水性糖殘基附著引起蛋白形成更加致密的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)內(nèi)部基團(tuán)不易暴露[28]，溶解度降低。但在等電點(diǎn)附近(pH=5～6)，大豆11S蛋白-葡聚糖(4、10 ku)軛合物溶解度高于未反應(yīng)大豆11S蛋白，這可能是由于大豆11S蛋白在等電點(diǎn)附近因疏水相互作用而形成結(jié)構(gòu)緊密的聚集體，阻礙了葡聚糖的進(jìn)一步結(jié)合，同時(shí)已經(jīng)結(jié)合在蛋白表面的多糖產(chǎn)生位阻效應(yīng)以防止大豆11S蛋白進(jìn)一步聚集而提高溶解性[29]。Xu等[30]也發(fā)現(xiàn)葡聚糖與肌原纖維蛋白濕法糖基化反應(yīng)后軛合物在等電點(diǎn)附近溶解性顯著提高。在非等電點(diǎn)環(huán)境中，大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)容易受到pH的影響發(fā)生破壞，蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，體現(xiàn)出較好的溶解性，對(duì)其進(jìn)行糖基化反應(yīng)反而會(huì)生成不溶性大分子產(chǎn)生不利影響。低分子質(zhì)量的葡聚糖形成的軛合物在堿性條件下比高分子質(zhì)量葡聚糖形成的軛合物具有更高的溶解性，這可能是由于低分子質(zhì)量多糖的空間位阻更小，更容易靠近蛋白質(zhì)的氨基，糖基化反應(yīng)的程度更大[31]。

大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)緊密，粒徑分布大于100 nm，溶解性較差[9]；葡聚糖具有良好的水溶性，但其糖基化修飾改善溶解度的效果不如葡萄糖、乳糖[32]。因此在對(duì)大豆11S蛋白進(jìn)行改性的過(guò)程中，應(yīng)選擇能夠提供更多羥基基團(tuán)的糖，同時(shí)輔以一些其他手段(如：酶解、超聲等)進(jìn)一步破壞大豆11S蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)溶解性的改善會(huì)更加明顯。

圖5 大豆11S蛋白糖基化反應(yīng)4 h后在不同pH 條件下溶解度變化

2.3.2 乳化活性(EA)及乳化穩(wěn)定性(ES)分析

如圖6所示，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物EA明顯低于改性前，EA隨反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)不明顯，這可能是由于糖基化反應(yīng)引入了更多的親水性糖殘基，破壞了水油界面平衡[33]，導(dǎo)致EA下降。大豆11S蛋白-4 ku葡聚糖軛合物EA最低，大豆11S蛋白-10 ku葡聚糖軛合物EA最高，這可能是受引入親水糖鏈和糖鏈所帶來(lái)的空間位阻的影響，低分子質(zhì)量葡聚糖引入糖鏈多，降低EA；高分子質(zhì)量葡聚糖糖鏈產(chǎn)生空間位阻大，提高EA。Dickinson等[34]和江連洲等[35]發(fā)現(xiàn)EA與表面疏水性、Zeta電位呈正相關(guān)，與本文結(jié)果相似。

改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物ES明顯高于改性前，ES隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，3種軛合物都在反應(yīng)4 h時(shí)，ES達(dá)到最大值。EA降低，反而導(dǎo)致ES上升，這意味著除了糖基化所帶來(lái)的對(duì)油水界面破壞外，ES更多受放置后油水界面形成的保護(hù)膜穩(wěn)定性影響，隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)軛合物在形成乳狀液的過(guò)程中與油滴的起始界面相應(yīng)變小，但接觸面一旦形成后，在隨后放置的過(guò)程中油水界面形成的保護(hù)膜反而更加穩(wěn)定[36]，ES上升。而當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到后期時(shí)，所形成的產(chǎn)物(褐變產(chǎn)物)會(huì)導(dǎo)致溶液絮凝和聚集，對(duì)ES產(chǎn)生了不利的影響[37]。

因此，不同分子質(zhì)量葡聚糖糖基化反應(yīng)改性大豆11S蛋白后對(duì)EA的影響是不利的，但對(duì)ES的影響是有利的，為了獲得更好的ES，低分子質(zhì)量(4 ku)葡聚糖、反應(yīng)時(shí)間4 h是理想的改性條件。

圖6 大豆11S蛋白糖基化反應(yīng)后乳化性和乳化穩(wěn)定性變化

2.3.3 持水性(WRC)及持油性(ORC)分析

如圖7，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物WRC均上升，ORC均下降。這可能是因?yàn)闈穹ㄌ腔磻?yīng)更加充分，增大了蛋白質(zhì)、糖與水分子的接觸面積，由于糖基化反應(yīng)中大豆11S蛋白的表面疏水性基團(tuán)可能與葡聚糖糖鏈結(jié)合，使其喪失在原有體系中相關(guān)疏水性的表達(dá)，疏水基團(tuán)不易暴露，因此WRC上升，ORC下降[38，39]。但隨著糖基化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞也使得疏水基團(tuán)暴露，因此WRC也會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，ORC出現(xiàn)上升趨勢(shì)。兩方面因素的共同作用導(dǎo)致WRC和ORC發(fā)生不斷地波動(dòng)，這與表面疏水性的波動(dòng)變化一致。大豆11S蛋白-70 ku葡聚糖軛合物由于參與反應(yīng)葡聚糖分子質(zhì)量較大，糖基化反應(yīng)速率較慢，WRC和ORC波動(dòng)并不明顯?？傮w而言，濕法糖基化反應(yīng)能夠有效改善大豆11S蛋白的WRC，抑制ORC，低分子質(zhì)量(4和10 ku)的葡聚糖對(duì)WRC的提高作用和對(duì)持油性的降低作用更明顯。

圖7 大豆11S蛋白糖基化反應(yīng)后持水性和持油性變化

3 結(jié)論

大豆11S蛋白與不同分子質(zhì)量(4、10、70 ku)的葡聚糖在濕法條件下發(fā)生了糖基化反應(yīng)，通過(guò)SDS-PAGE和熒光光譜分析證實(shí)了大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的形成，同時(shí)也表明糖基化反應(yīng)程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加深，4 h是理想的改性時(shí)間。糖基化反應(yīng)過(guò)程中親水性糖鏈的附著使得大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)更加致密，破壞水油界面平衡，內(nèi)部基團(tuán)不易暴露，因此大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物與未處理的大豆11S蛋白相比表面疏水性、Zeta電位值、ORC、EA和在非等電點(diǎn)處(pH=3.0～4.0，7.0～9.0)溶解性均下降，WRC上升；而在等電點(diǎn)附近(pH=5.0～6.0)大豆11S蛋白易形成聚集物會(huì)阻礙葡聚糖進(jìn)一步結(jié)合，同時(shí)已結(jié)合的葡聚糖產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)使得軛合物溶解性增加，ES的上升主要與放置后油水界面形成的保護(hù)膜的穩(wěn)定性有關(guān)。另外，低分子質(zhì)量葡聚糖對(duì)大豆11S蛋白濕法糖基化改性程度最大，對(duì)功能性質(zhì)的影響更明顯。由于大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)緊密，糖基化修飾對(duì)增強(qiáng)大豆11S蛋白表面活性的效果有限，為了獲得更加理想的表面活性，選擇一些輔助手段對(duì)大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞、暴露更多內(nèi)部基團(tuán)以獲得更好的糖基化效果是未來(lái)研究趨勢(shì)。