連銳銳,李桂明,孫傳熙,李 真,劉月月,楊世發(fā),林樹乾,石有斐,殷 斌*,萬仁忠*
(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東泰安 271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所,山東濟南 250023)
熱應激(heat stress)是指機體遭受環(huán)境溫度超過等熱區(qū)上限的高溫度刺激時,導致機體產(chǎn)生的一系列非特異性反應,也稱為熱應激反應。短暫的過高溫刺激或長時間持續(xù)熱應激,會導致動物機體出現(xiàn)器官衰竭,嚴重時甚至會促發(fā)死亡。在我國,大部分地區(qū)每年夏天都會出現(xiàn)超過動物等熱區(qū)上限的持續(xù)高溫天氣(35 ℃~40 ℃),不僅會影響畜禽產(chǎn)品品質(zhì),還會影響動物的生產(chǎn)、繁殖、健康、福利,對包括人類在內(nèi)的動物生命構成了嚴重的威脅[1-2]。家禽缺少汗腺,對熱敏感,熱應激成為影響家禽生產(chǎn)性能的關鍵問題之一[3]。
熱應激會導致蛋白質(zhì)變性、聚集,使可溶性蛋白轉變?yōu)椴豢扇苄缘鞍仔罘e在細胞內(nèi),造成蛋白穩(wěn)態(tài)的失衡,對機體造成損傷。熱休克反應(heat shock response,HSR)是機體在遭受應激刺激時,以上調(diào)熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)為特征的防御性適應反應,可以有效緩解蛋白穩(wěn)態(tài)的失衡[4]。HSP作為分子伴侶,可以幫助蛋白質(zhì)的正確折疊、移位、復性和降解,還可以維持細胞骨架結構發(fā)揮重要的內(nèi)源性保護作用,可被缺氧、缺血、熱應激、氧化應激等各種短暫的應激所激活[5-7]。Hsps是否能被正常激活,決定對應激的耐受性是否形成,其表達量與細胞對應激的耐受性呈正相關。采用藥物刺激(如阿司匹林、輔酶Q10)誘導Hsp70高表達,會增加細胞在同等熱應激條件下的存活率[8-9],而采用Hsp70的抑制劑(槲皮素)會導致細胞在熱應激條件下的存活率會顯著下降[10]。過表達CRYAB可以通過穩(wěn)定細胞骨架結構和調(diào)控細胞周期,顯著提高心肌細胞H9C2的耐熱性,且其保護效果與CRYAB過表達量成正相關[11]。HSP參與細胞抗凋亡的各個途徑,其提高細胞的耐受性與HSP抗細胞凋亡的作用密切相關,但熱應激條件下,HSP如何調(diào)控細胞凋亡的作用機制目前尚不清晰。
本研究基于系統(tǒng)生物學分析方法,獲取家禽與熱應激相關的基因,通過GO富集分析方法,篩選出調(diào)控細胞凋亡相關的基因,并利用STRING數(shù)據(jù)庫分析其相互間作用關系。為進一步確定熱應激激活HSP的高表達,發(fā)揮內(nèi)源性保護作用,以300日齡蛋雞構建熱應激試驗動物模型,探討不同的熱應激時間點對家禽的損傷以及對HSP的誘導規(guī)律,為揭示HSP在熱應激損傷中發(fā)揮的作用提供依據(jù)。
1.1.1 試驗用動物 300日齡健康海蘭褐蛋雞40只,購自濟南鳴仁畜牧養(yǎng)殖有限公司。
1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、TB Green Premix ExTaqⅡ(2x),日本TaKaRa公司產(chǎn)品。
1.1.3 主要儀器 光學顯微鏡,重慶重光實業(yè)有限公司產(chǎn)品;低溫冷凍離心機(Sorval Legend Micro 17 R),美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;PCR儀,美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀(QuantStudio7 Flex),美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。
1.2.1 受試雞熱應激模型的構建及樣品采集 40只300日齡海蘭褐蛋雞隨機分為4組,分別為熱應激0、1、3、5 d組,每組10只。按組分群后在控溫控濕的環(huán)境(溫度25 ℃±1 ℃,相對濕度約60%)中進行為期7 d的適應性飼養(yǎng),試驗期間自由飲食、飲水。待適應期結束后,進入熱應激處理期,熱應激溫度為38 ℃2 ℃,濕度保持在60%,熱應激期間自由飲食、飲水,分別進行0、1、3、5 d的熱應激處理。熱應激期間實時觀察受試雞的行為狀態(tài),熱應激結束采集血液和心臟組織。采集的血液立刻分離血清后,用于雞心肌細胞損傷相關酶的檢測;心臟組織分別置于40 mg/mL甲醛和液氮中,以備組織病理學和分子生物學檢測。
1.2.2 心肌損傷酶譜的檢測 雞血清中肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST)的檢測,送至濟南金域檢測中心檢測采用自動生化分析儀進行。
1.2.3 受試雞心肌組織應激性病理損傷檢測 取出固定于40 mg/mL甲醛中的心臟組織,經(jīng)過梯度濃度乙醇脫水后進行二甲苯透明處理,然后完成組織的石蠟包埋、切片和HE染色程序,并在400倍顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化。
1.2.4 受試雞心肌組織Hsp轉錄水平的動態(tài)檢測 從凍存管內(nèi)取出心肌組織,用滅菌剪刀在心尖位置剪取約0.2 g的組織于1.5 mL滅菌離心管內(nèi),加入200 μL RNAiso Plus,用研磨棒進行研磨,研磨充分后再加入800 μL RNAiso Plus充分裂解組織,冰上裂解10 min后,加入200 μL氯仿,混勻約30 s,冰盒上放置5 min后,12 000 r/min 4 ℃下離心15 min。取上清液約500 μL轉移至新的離心管,按等體積的比例加入異丙醇,上下顛倒混勻,置于-20 ℃環(huán)境中靜置沉淀1 h。冰箱內(nèi)取出后12 000 r/min 4 ℃下離心15 min,棄掉上清液。各管加入預冷的750 mL/L乙醇1 mL,上下顛倒洗滌,7 500 r/min、 4 ℃離心5 min,棄掉上清,再以7 500 r/min 、4 ℃離心2 min,用移液槍小心吸干殘留乙醇,室溫下干燥3 min。加入無RNA酶滅菌水20 μL,吹打溶解RNA,溶解后的RNA進行濃度與純度檢測。
反轉錄采用10 μL體系,按照說明書進行,反轉錄得到的cDNA置于-80 ℃保存,備用。Real-time PCR所需要的引物根據(jù)NCBI中已發(fā)表的雞Cryab、Hsp27、Hsp70、以及Gapdh的基因序列為參照模板,用Primer 5.0 軟件設計,由濟南博尚公司合成,引物序列見表1。cDNA模板經(jīng)過5倍稀釋后使用,real-time PCR反應采用20 μL體系:2×TB Green Premix ExTaq10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,cDNA 2 μL,RNase-free水6.4 μL。擴增程序為:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。每個樣品基因的相對表達水平根據(jù)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)Ct值標準化,并使用2-ΔΔCt方法定量。
1.2.5 基于網(wǎng)絡藥理學探究Hsps調(diào)控細胞凋亡的作用機制
1.2.5.1 家禽熱應激作用靶標間相互作用網(wǎng)絡的構建 通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫Gene檢索板塊,查找與家禽熱應激相關的疾病靶標。利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),獲得家禽熱應激相關靶標間的相互作用關系,篩選評分≥0.7的相互作用關系作為可信的相關作用關系,并導入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡可視化分析。利用Cytoscape軟件中network analyze功能中“generate style from statistics”的板塊獲取網(wǎng)絡中靶標的自由度、介數(shù)、接近中心性和平均最短路徑長度等信息,并按照自由度由小到大,顏色由黃到紅進行注釋,構建家禽熱應激作用靶標間相互作用網(wǎng)絡。
1.2.5.2 家禽熱應激調(diào)控細胞凋亡作用靶標的篩選及相互作用關系的分析 家禽熱應激作用靶標導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫,基因類型選擇Official Gene Symbol,物質(zhì)信息和基因背景均選擇Gallus gallus,進行GO富集分析,獲得負調(diào)控細胞凋亡的作用靶標(negative regulation of apoptotic process)。將獲得的熱應激條件下調(diào)控細胞凋亡的作用靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫,獲得靶標間相關作用關系網(wǎng)絡和蛋白共表達間關系。
表1 RT-PCR引物序列
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗均采用3個平行,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(standard deviation,SD)表示。試驗組之間的差異使用SPSS軟件v.20.0,通過單向方差分析(ANOVA)和最小顯著差異(LSD)多重比較測試方法分析。*和**分別表示P<0.05和P<0.01。
受試雞遭受熱應激4 h時,明顯出現(xiàn)張口呼吸、劇烈喘息的表現(xiàn),拒食、但飲水量增加;伴隨熱應激時間的增加,受試雞的活動量減少,伏于籠底部;當熱應激持續(xù)至2 d時,熱應激的狀態(tài)有所緩解,受試雞飲食逐漸恢復,張口呼吸的癥狀也有所減輕;當熱應激持續(xù)至5 d時,受試雞的行為和呼吸基本恢復。
受試雞血清內(nèi)心肌損傷相關酶CK、CK-MB、LDH和AST在熱應激條件下的動態(tài)變化如圖1所示。由圖1可以看出,熱應激1 d會上調(diào)受試雞血清中CK(P<0.01)和CK-MB(P<0.05)的水平;當熱應激持續(xù)至3 d時,CK和CK-MB的水平有所恢復,與正常條件下的水平無差異;當熱應激持續(xù)至5 d時,CK和CK-MB的水平均極顯著高于熱應激0 d組(P<0.01)。另外,熱應激5 d會上調(diào)LDH(P<0.01)和AST(P<0.05)的水平。
A.肌酸激酶;B.肌酸激酶同工酶;C.乳酸脫氫酶;D.谷草轉氨酶
熱應激導致的雞心肌組織的病理性損傷結果見圖2。當受試雞處于熱應激環(huán)境時,心肌組織出現(xiàn)損傷,具體表現(xiàn)為熱應激1 d會導致心肌細胞的顆粒變性(→)和空泡變性(↑);當熱應激持續(xù)至3 d時,顆粒變性和空泡變性加重;當熱應激持續(xù)至5 d時,心肌細胞顆粒變性和空泡變性繼續(xù)加重,并開始出現(xiàn)核濃縮、核深染為特點的壞死(←)。
受試雞心肌組織中Hsp的轉錄水平如圖3所示。熱應激會激活Hsp的轉錄,在遭受38 ℃熱應激刺激時,持續(xù)至3 d時會上調(diào)Cryab(P<0.05)和Hsp70的轉錄水平,在熱應激5 d時,Hsp60、Hsp70和Hsp90均呈現(xiàn)極顯著上調(diào)(P<0.01)。
基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫Gene檢索板塊,共獲得與家禽熱應激相關的基因靶標共198個,將其導入STRING數(shù)據(jù)庫共獲得1 514條相關作用關系,篩選評分≥0.7的相互作用關系有530條。530條相互作用關系導入Cytoscape軟件,進行可視化分析,獲得家禽熱應激作用靶標間相互作用網(wǎng)絡見圖4,其中橢圓代表蛋白靶標,其顏色由黃-紅按自由度升序標注。由圖4可以看出DNAJC6、HSPA9、HSPA8、HSPA2、HSPA4、HSPA5、HSP90AA1、HSPH1、SUGT1、HSP90AB1、GAK和HSPA4L自由度較高,均≥21,在家禽遭受熱應激時發(fā)揮重要的作用。
A.0 d;B.1 d;C.3 d;D.5 d。心肌細胞應激性病理損傷,顆粒變性(→)、空泡變性(↑)、細胞壞死(←)
A.cryab mRNA;B.hsp60 mRNA;C.hsp70 mRNA;D. hsp90 mRNA
橢圓代表蛋白靶標,其顏色由黃-紅按自由度升序標注
將獲得的與家禽熱應激相關的198個基因靶標,導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析,篩選與調(diào)控細胞凋亡相互的作用靶標見表2。發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白家族成員CRYAA、HSP90AB1、HSP90B1、HSPA5、HSPD1、DNAJA1和DNAJC3均參與熱應激條件下調(diào)控家禽細胞凋亡的進程。將獲得的調(diào)控細胞凋亡的作用靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫,進行相互間作用分析,獲得相互間作用網(wǎng)絡見圖5,獲得靶標間共表達結果見圖6。Hsp90AB1和Hsp90B1可以調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1),Hsp90AB1和HspD1可以與CDK1共表達,影響細胞周期。Hsp90B1、DNAJC3和IGF1可以調(diào)控白介素6(interleukin 6,IL-6),影響細胞因子的表達,從而影響細胞凋亡。
表2 家禽熱應激調(diào)控細胞凋亡的作用靶標
圖5 熱應激調(diào)控家禽細胞凋亡的靶標間相互作用網(wǎng)絡
圖6 熱應激調(diào)控家禽細胞凋亡的靶標共表達網(wǎng)絡
應激(stress)是一種由多種應激原作用于動物機體而造成機體非特異性損傷的反應。應激原在畜禽生長發(fā)育過程中普遍存在,如夏天高溫時節(jié)的熱應激、長途運輸時的運輸應激等。隨著集約化養(yǎng)殖和全球氣溫變暖趨勢的影響,熱應激已經(jīng)成為影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大因素之一。當環(huán)境溫度超過各種動物的舒適區(qū)上限時,動物就會出現(xiàn)熱應激反應,環(huán)境溫度超過舒適區(qū)上限越高、持續(xù)時間越長,熱應激反應的程度就越嚴重。2003年美國因熱應激造成了1.69億~ 23.6億美元的損失[12]。在我國,大部分地區(qū)每年夏天都會出現(xiàn)超過各種家畜、家禽等熱區(qū)上限的持續(xù)高溫天氣(35 ℃~40 ℃),造成動物免疫力下降及各種疾病,甚至猝死。此外,熱應激還會降低肉品品質(zhì),降低母豬的產(chǎn)奶量和仔豬的斷奶重量[13-15]、肉雞日增重[16-18]、蛋雞體重和蛋殼厚度[19],引起火雞的死亡率升高[20]。由于熱應激與其他傳染病的致病因素不同,其對動物機體的損害是非特異性的,引起的動物疾病甚至死亡因素并不單一,且目前尚無有效的解決和控制辦法,因此研究熱應激對動物機體的損傷機制以及動物機體的應答措施,對防止動物熱應激損傷及篩選抗熱應激藥物具重要的實際意義。
心臟對熱敏感。鮑恩東等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)熱應激可導致肉雞的心肌纖維斷裂等病理變化。熱應激導致動物死亡的原因可能與熱應激對心肌細胞的損傷有關。本試驗結果顯示,熱應激1 d會導致心肌細胞的顆粒變性和空泡變性,該病理損傷會隨熱應激時間的持續(xù)而加重,在熱應激持續(xù)5 d時,出現(xiàn)核濃縮、核深染為特點的壞死。細胞作為構成生命機體的基本單元,同樣具有抗損傷的功能。當細胞受到應激刺激時,會啟動自身的內(nèi)源性保護機制來抵抗損傷。
動物細胞在受到應激刺激時會上調(diào)相關功能蛋白的基因轉錄水平,從而上調(diào)功能性蛋白質(zhì)翻譯水平,主要通過暫時的升高HSP的表達水平來增強細胞耐受性以及存活率。HSP作為重要的內(nèi)源性保護機制參與蛋白,協(xié)助機體適應環(huán)境的變化,抵抗應激造成的損傷。各種應激刺激如缺氧、缺血、冷應激、熱應激、創(chuàng)傷、感染等都可誘導HSP的表達。研究發(fā)現(xiàn),HSP表達量與細胞抗損傷能力呈正相關,因此,HSP被認為是衡量機體抵抗外應激刺激能力的重要指標。HSP具有眾多生物學功能。在大多數(shù)生物體中表達的CRYAB可作為分子伴侶穩(wěn)定細胞骨架結構,并且參與細胞周期與凋亡通路的調(diào)控[22]。Hsp60主要分布在線粒體中,在各種脅迫條件下重新折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)中起重要作用[23]。Hsp70在抗細胞損傷中發(fā)揮重要作用,其誘導表達可以有效提高細胞存活率并減輕應激損傷[24]。熱應激還誘導Hsp90高表達,Hsp90與促生存/抗凋亡信號轉導途徑密切相關,且Hsp90還可以幫助其客戶蛋白維持其正確的分子結構[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)38 ℃熱應激,會在3 d時會上調(diào)Cryab和Hsp70的轉錄水平,在熱應激持續(xù)5 d時,Hsp60、Hsp70和Hsp90均呈現(xiàn)極顯著上調(diào),這一結果也反映出HSP在細胞抵抗損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。
細胞凋亡是細胞遭受損傷時發(fā)生的重要生物學過程,本研究發(fā)現(xiàn)熱應激條件下,HSP在調(diào)控細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用,尤其是Hsp60、Hsp70和Hsp90家族。通過蛋白靶標間互作分析和共表達分析,發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1和Hsp90B1可以調(diào)控CDK1,Hsp90AB1和HspD1可以與CDK1共表達,影響細胞周期。Hsp90B1、DNAJC3和IGF1可以調(diào)控白介素6(interleukin 6,IL-6),影響細胞因子的表達,從而影響細胞凋亡。這一結果為探索HSP在抗熱應激損傷的機制方面提供了理論依據(jù)。