豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗的研制

郭振剛，胡江鋒，王 婷，王晶鈺*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100;2.楊凌綠方生物工程有限公司，陜西楊凌 712100)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種感染豬以嘔吐、腹瀉、脫水、厭食和迅速消瘦為主要特征的高度接觸性腸道傳染病[1]。在自然條件下，PEDV通過口鼻途徑進(jìn)入豬體內(nèi)，各種年齡和品種的豬都有易感性，但對哺乳仔豬和育肥豬的危害更大，尤其對哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率為30%～80%[2-3]。1971年，PEDV在英國首次被鑒定并確定為豬流行性腹瀉的致病因子[4]，PED呈世界范圍性流行。自1984年證明我國存在PEDV開始，該病在國內(nèi)流行面逐漸擴(kuò)大，并在2010年末以后在我國大部分地區(qū)呈暴發(fā)流行[5]。PED多與豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6-10]。

因飼養(yǎng)管理水平的差異，單次疫苗接種并不能完全保證免疫后產(chǎn)生有效的中和抗體[10]。PED現(xiàn)有疫苗在不同地區(qū)的免疫保護(hù)力存在一定差異，可能是PEDV流行多年出現(xiàn)變異，以致于疫苗株與流行毒株的基因同源性較低以及關(guān)鍵免疫位點發(fā)生突變有關(guān)。大量PEDV分子流行病學(xué)研究顯示，2010年-2016年間的PEDV流行毒株與CV777等疫苗株的同源性較低，尤其在毒力決定基因S上存在較多突變[11-14]。因此，迫切需要能保護(hù)仔豬免受PEDV流行毒株感染的安全高效且廉價的疫苗。

本研究從甘肅某地暴發(fā)腹瀉的豬場中，采集因腹瀉病死的7日齡內(nèi)仔豬的小腸組織及內(nèi)容物，經(jīng)過病毒分離、鑒定和培養(yǎng)，獲得PEDV分離株，以該毒株制備全病毒滅活疫苗并開展了免疫效力研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織病料 從甘肅某地暴發(fā)仔豬腹瀉的豬場中，采集病死豬的小腸組織及其內(nèi)容物42份。

1.1.2 細(xì)胞及血清 Vero細(xì)胞、PEDV特異性陽性血清、豬流行性腹瀉病毒陰性血清，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系獸醫(yī)公共衛(wèi)生與畜禽產(chǎn)品安全實驗室保存。

1.1.3 試驗用動物 PEDV中和抗體不高于1∶4的產(chǎn)前6周的妊娠母豬，由陜西省渭南市大荔縣生態(tài)養(yǎng)豬場提供。

1.1.4 主要試劑 MEM培養(yǎng)基，HyClone公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；病毒基因組RNA提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、隨機(jī)引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；油包水佐劑ISA 61VG和水包油包水佐劑賽彼科 ISA 206，賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；普通細(xì)菌搖床，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心產(chǎn)品；PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 從甘肅某地暴發(fā)腹瀉的豬場中，采集病死豬的小腸組織及其內(nèi)容物42份。用pH 7.2～7.4的PBS按1∶10(W/V)研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，無菌吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾后接種于生長良好的單層Vero細(xì)胞，吸附1 h后，棄去病毒液，PBS(pH 7.2)清洗3次后，加入細(xì)胞維持液，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變，如此盲傳至細(xì)胞出現(xiàn)病變，反復(fù)凍融細(xì)胞，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)液即病毒液，置-70 ℃保存。

1.2.2 病毒鑒定

1.2.2.1 RT-PCR檢測 按照試劑盒說明書提取RNA，用PEDV特異性引物(PEDV-F:5’-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3’；PEDV-R:5’-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’)進(jìn)行鑒定，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為645 bp，以商品化疫苗毒CV777核酸作為陽性對照，引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2.2 病毒中和試驗 將病毒稀釋成200 TCID50/0.1 mL，與等量的PEDV特異性陽性血清混合，置37 ℃作用60 min，接種到長成良好單層的Vero細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種4孔，100 μL/孔，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，同時設(shè)陰性血清對照、正常細(xì)胞對照組和未中和病毒對照組，每日觀察各組細(xì)胞病變情況。

1.2.3 病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.3.1 Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的Vero細(xì)胞，置37 ℃水浴中解凍，1 000 r/min離心15 min，棄掉上清，分別用含60、80、100、120 mL/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸接種25 cm2細(xì)胞瓶，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層，記錄不同時間細(xì)胞瓶內(nèi)細(xì)胞的生長比例，確定最佳血清使用含量。用2.5 mg/mL胰酶消化后，按1∶3～1∶5傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3.2 病毒轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、收獲及毒價測定 將175 cm2培養(yǎng)瓶中已長成良好單層的Vero細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，按0.1%、0.2%、0.5%(V/V)的比例加入毒種，并加入30 mL MEM培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄不同稀釋度病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變孔數(shù)，5 d～7 d后按Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.4 病毒滅活條件優(yōu)化

1.2.4.1 病毒滅活 取病毒液3瓶(500 mL/瓶)，分別加入終濃度分別為0.5、0.7、1 mg/mL的甲醛溶液，2 ℃～8 ℃放置72 h進(jìn)行病毒滅活，在滅活24、48、60、72 h時取樣，進(jìn)行滅活檢驗和無菌檢驗。

1.2.4.2 病毒滅活檢驗 將滅活好的病毒液接種至已長成良好單層的Vero細(xì)胞(25 cm2細(xì)胞瓶)，每瓶1 mL，吸附1 h后棄液，加入MEM培養(yǎng)基5 mL，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，置-15 ℃以下凍融細(xì)胞，將上一代的細(xì)胞凍融液接種至下一代細(xì)胞瓶中，如此進(jìn)行，將細(xì)胞液再盲傳2代。觀察并記錄是否出現(xiàn)細(xì)胞病變。

1.2.4.3 無菌檢驗 將滅活檢驗合格的病毒液按2015版《中國獸藥典》附錄[15]進(jìn)行無菌檢驗。

1.2.5 疫苗制備 將抗原與水包油包水佐劑賽彼科佐劑ISA 206(質(zhì)量比1∶1)、油包水佐劑賽彼科ISA 61 VG(質(zhì)量比1∶1)按照下面方法配制疫苗。

1.2.5.1 油包水佐劑賽彼科 ISA 61 VG疫苗的制備 將賽彼科 ISA 61 VG佐劑加入燒杯，將均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)頭連同常用的柵格放入佐劑中，緩緩加入，逐漸加大攪拌速度至14 000 r/min，攪拌頭置于液體一半高度的位置。室溫條件下乳化3 min，室溫靜置24 h。

1.2.5.2 水包油包水佐劑賽彼科疫苗的制備 取制備的滅活PEDV毒液和賽彼科 ISA 206，分別加熱至30 ℃±2 ℃，將佐劑倒入燒杯中，并將溫度保持在30 ℃，以200 r/min攪拌并逐漸將病毒液緩慢加入。待病毒液全部加入后，提高攪拌速度至300 r/min，30 ℃持續(xù)攪拌20 min～30 min。將容器冷卻至15 ℃以下，并在冷卻過程中持續(xù)攪拌，最后將乳液在15 ℃靜置24 h。

1.2.6 疫苗檢驗

1.2.6.1 穩(wěn)定性檢驗 取上述制備的疫苗各10 mL置離心管中，3 000 r/min離心15 min，觀察這兩種疫苗的水相析出量。

1.2.6.2 黏度檢驗 將兩種疫苗均按2015版《中國獸藥典》附錄[15]進(jìn)行檢驗。

1.2.6.3 安全性 取3日齡～5日齡仔豬15頭，分為3組，每組5頭，2組為試驗組，1組為對照組。每種疫苗頸部肌肉注射接種一組豬，2.0 mL/頭，對照組以相同方式注射生理鹽水2.0 mL/頭。免疫后14 d內(nèi)，每天測定各組豬體溫，觀察各組豬采食、飲水、精神是否正常，有無不良臨床反應(yīng)，疫苗的吸收情況及注射部位是否有異常反應(yīng)。

1.2.6.4 效力檢驗 取3日齡～5日齡健康仔豬15頭，分為3組，每組5頭，其中1組為對照組，其他2組為試驗組。每種疫苗頸部肌肉注射一組試驗豬，1.0 mL/頭，免疫后14 d按相同方式與劑量進(jìn)行二次免疫，對照組接種1.0 mL滅菌生理鹽水。二次免疫后7 d，各組豬分別采血，測定PEDV中和抗體。

1.2.7 豬流行性腹瀉滅活疫苗臨床安全性試驗 安全性試驗按照表1進(jìn)行，在產(chǎn)前6周每頭母豬頸部肌肉注射疫苗4 mL，產(chǎn)前3周按照同樣的劑量和方法進(jìn)行二次免疫。共免疫母豬30頭，同時設(shè)不免疫母豬30頭作為對照組。觀察免疫后采食、飲水、精神狀況及不良臨床反應(yīng)，統(tǒng)計母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、異常胎兒及產(chǎn)仔數(shù)情況。

表1 母豬安全性試驗時間表

1.2.8 豬流行性腹瀉滅活疫苗臨床免疫試驗 在產(chǎn)前6周每頭母豬頸部肌肉注射疫苗2 mL，產(chǎn)前3周按照同樣的劑量和方法進(jìn)行二次免疫。共免疫接種母豬30頭。觀察免疫接種后采食、飲水、精神狀況及不良臨床反應(yīng)，統(tǒng)計母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、異常胎兒及產(chǎn)仔數(shù)情況。有效性試驗按照表2進(jìn)行，

表2 母豬疫苗免疫試驗時間表

1.2.9 免疫效果試驗 免疫效果試驗使用20頭PEDV陽性母豬，分2組，每組10頭，其中1組為對照組。在產(chǎn)前40 d每頭母豬頸部肌肉注射疫苗2 mL，產(chǎn)前20 d按照同樣的劑量和方法進(jìn)行二次免疫。對照組接種2 mL滅菌生理鹽水。統(tǒng)計產(chǎn)仔數(shù)量，仔豬情況和仔豬16日齡存活數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

病料接種Vero細(xì)胞后，盲傳F5代，培養(yǎng)96 h后，產(chǎn)生細(xì)胞病變，表現(xiàn)為合胞體、細(xì)胞呈灶狀脫落等(圖1)。再繼續(xù)傳至第F10代，收獲培養(yǎng)物，標(biāo)記為PEDV GS株F10代，置-70 ℃以下保存。

A.對照Vero細(xì)胞；B.接種PEDV后病變的Vero細(xì)胞

2.2 病毒鑒定

2.2.1 RT-PCR檢測 提取細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為645 bp的目的條帶(圖2)。結(jié)果表明分離毒株為PEDV。

2.2.2 病毒中和試驗 將PEDV-GS株與特異性陽性血清孵育60 min后，接種Vero細(xì)胞。結(jié)果顯示，病毒中和組及正常細(xì)胞對照組均不產(chǎn)生細(xì)胞病變，陰性血清對照組、未中和病毒對照組產(chǎn)生細(xì)胞病變，說明分離株能夠被PEDV特異性陽性血清完全中和。

2.3 病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化

將復(fù)蘇的Vero細(xì)胞分別用不同含量新生牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)至致密單層，記錄不同時間細(xì)胞瓶內(nèi)細(xì)胞的生長比例。結(jié)果表明，以80 mL/L含量添加新生牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，能達(dá)到最佳細(xì)胞傳代所需的生長狀態(tài)(表3)。將PEDV-GS株按照不同比例接種Vero細(xì)胞，接種后不同時間收獲病毒液，測定病毒含量。結(jié)果表明，以5 mL/L的比例接種后培養(yǎng)48 h～72 h，病毒含量達(dá)到高峰(表4)。因此,將PEDV-GS株的最佳培養(yǎng)條件確定為以80 mL/L含量添加新生牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，5 mL/L的比例接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)48 h～72 h收獲病毒。

1.陰性對照；2.PEDV GS F10；3.陽性對照

表3 Vero細(xì)胞在不同含量血清的MEM 培養(yǎng)基中不同時間生長情況觀察

2.4 病毒滅活條件優(yōu)化

2.4.1 滅活條件的確定 將病毒液中加入不同濃度的甲醛，滅活不同時間取樣，進(jìn)行滅活檢驗。結(jié)果顯示，當(dāng)甲醛終濃度不低于0.7 mg/mL時，滅活時間不少于48 h，病毒可被完全滅活(表5)。

2.5 疫苗檢驗

2.5.1 穩(wěn)定性 取配制的2種疫苗各10 mL于離心管中，以3 000 r/min離心15 min，2種疫苗水相析出均不大于0.2 mL，表明2種疫苗的穩(wěn)定性良好。

2.5.2 黏度檢驗 將2種疫苗按2015版《中國獸藥典》附錄[15]進(jìn)行檢驗，2種疫苗黏度均小于200 cP(表7)，符合標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同比例接種后培養(yǎng)不同時間病毒 含量測定結(jié)果(TCID50/mL)

表5 不同濃度甲醛滅活不同時間后病毒滅活檢驗結(jié)果

2.4.2 無菌檢驗 將滅活檢驗合格的病毒液進(jìn)行無菌檢驗。結(jié)果表明，滅活檢驗合格的病毒液均無菌生長(表6)。

表6 滅活后病毒無菌檢驗結(jié)果

2.5.3 安全性 將2種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫試驗豬，并在免疫前1 d和免疫當(dāng)天及免疫后14 d內(nèi)每天測定各組試驗豬體溫。結(jié)果表明，2種疫苗免疫組豬及對照組豬體溫均正常(表8)。此外，免疫后14 d內(nèi)，2種疫苗免疫豬采食、飲水、精神狀況均正常，均無不良臨床反應(yīng)，疫苗吸收良好，注射部位均無紅腫、硬塊等局部異常反應(yīng)，與對照組無明顯差異。

表7 疫苗黏度檢驗結(jié)果

表8 疫苗接種試驗豬體溫測定結(jié)果

2.5.4 抗體檢測 免疫后不同時間測定各組試驗豬PEDV中和抗體。二次免疫后7 d，ISA 61 VG免疫組PEDV中和抗體均不低于1∶32，ISA 206免疫組和Merckinade SDA 25免疫組PEDV中和抗體均不低于1∶16，對照組PEDV中和抗體均<1∶4(表9)。

用同一批次滅活檢驗合格后的病毒(滅活前病毒含量為107.0TCID50/mL)根據(jù)佐劑使用說明書配制疫苗，ISA 61 VG佐劑疫苗抗原含量與ISA 206佐劑疫苗抗原含量相當(dāng)。用同樣劑量免疫接種仔豬后，ISA 61 VG佐劑疫苗的中和抗體高于ISA 206佐劑疫苗組。根據(jù)上述試驗結(jié)果，確定在豬流行性腹瀉滅活疫苗(GS株)生產(chǎn)中使用賽彼科ISA 61 VG佐劑。

2.6 臨床試驗

2.6.1 安全性試驗 免疫妊娠母豬后，免疫組和對照組采食、飲水、精神狀況均正常，沒有出現(xiàn)不良臨床反應(yīng)。免疫組共產(chǎn)仔434頭，其中有3頭弱胎，無早產(chǎn)和流產(chǎn)現(xiàn)象；對照組共產(chǎn)仔422頭，其中有4頭弱胎、1頭早產(chǎn)，無流產(chǎn)現(xiàn)象。免疫組和對照組沒有明顯差異(表10)。

2.6.2 仔豬免疫效果試驗 仔豬的母源中和抗體檢測：疫苗免疫妊娠母豬后，其所產(chǎn)7日齡仔豬的母源抗體中和效價在1∶128～1∶256之間，所產(chǎn)14日齡仔豬的中和抗體在1∶64～1∶128之間，所產(chǎn)21日齡、28日齡的中和抗體均在1∶32～1∶64之間(表11和圖3)。

綜上所述，在大荔生態(tài)養(yǎng)豬場對妊娠母豬進(jìn)行安全性試驗和免疫效果試驗，結(jié)果表明豬流行性腹瀉滅活疫苗(GS株)對妊娠母豬是安全有效的，其被動免疫抗體至少持續(xù)至仔豬產(chǎn)后28 d。

2.6.3 免疫效果試驗 免疫組共產(chǎn)仔125頭，其中有2頭弱胎，1頭死胎，16日齡存活62頭；對照組共產(chǎn)仔118頭，其中有1頭弱胎，1頭死胎，16日齡存活29頭。免疫組的仔豬存活率顯著高于對照組(表12)。

綜上所述，在豬場對妊娠母豬進(jìn)行安全性試驗、有效性試驗和免疫效果試驗，結(jié)果表明豬流行性腹瀉滅活疫苗對妊娠母豬是安全有效的，對于仔豬有顯著的保護(hù)力，其被動免疫抗體至少持續(xù)至仔豬產(chǎn)后28 d。

表9 各試驗組免疫后PEDV中和抗體檢測結(jié)果

表10 母豬安全性試驗結(jié)果

表11 仔豬母源抗體檢測結(jié)果

圖3 被動免疫中和抗體檢測

3 討論

自2010年10月起，我國大范圍暴發(fā)了數(shù)次豬流行性腹瀉疫情，引起了100多萬仔豬病亡，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。截止到2018年，國內(nèi)PEDV疫苗獲得新獸藥證書5個，共有18個企業(yè)的6種PEDV疫苗獲得有效批準(zhǔn)文號23個[16]。但在不同地區(qū)，現(xiàn)有疫苗的免疫效果存在一定差異，這可能和疫苗株與流行毒株的基因同源性較低，以及流行毒株關(guān)鍵免疫位點的突變有關(guān)，大量分子流行病學(xué)研究報道顯示，2010年-2016年間的PEDV流行毒株與CV777等疫苗株的同源性較低，尤其在毒力決定基因S上存在較多突變[17-18]。

本試驗從甘肅某地暴發(fā)腹瀉的豬場中，取病死的7日齡內(nèi)的仔豬的小腸組織及內(nèi)容物，用在Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10 μg/mL胰酶進(jìn)行培養(yǎng)，病毒盲傳到第5代后，出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，經(jīng)過RT-PCR檢測、病毒中和試驗等鑒定，確定分離出1株P(guān)EDV，將其傳代至F10代，作為候選疫苗株。甲醛是常用的滅活劑，其原理是通過對病毒蛋白羧基端發(fā)生作用，從而使病毒失活，喪失感染性[19]。本試驗對甲醛的最小使用量進(jìn)行了研究，確定了其最小使用劑量為終濃度0.7 mg/mL，在中國獸藥典規(guī)定范圍之內(nèi)，保證了疫苗的安全性。

在研制疫苗的過程中對佐劑篩選進(jìn)行了研究，ISA 61 VG油包水佐劑疫苗抗原含量與ISA 206水包油包水佐劑疫苗抗原含量相當(dāng)，但用同樣劑量免疫仔豬后，油包水佐劑疫苗的中和抗體高于水包油包水佐劑疫苗組，所以最終選擇了中和抗體較高的賽彼科ISA 61 VG油包水佐劑作為本疫苗的佐劑，研制了豬流行性腹瀉滅活疫苗。

表12 免疫效果試驗結(jié)果

疫苗作為外源物，尤其妊娠母豬對于應(yīng)激反應(yīng)更為敏感，所以，疫苗的安全性需要重點討論。豬流行性腹瀉主要是危害7日齡以內(nèi)的仔豬，在這個時間段仔豬的抗體，主要來自母源抗體，在臨床使用過程中，被動免疫就顯得尤為重要[20]。因此，在臨床試驗中，主要進(jìn)行了疫苗安全性試驗、有效性試驗和免疫效果試驗，試驗結(jié)果顯示，免疫接種兩次疫苗的妊娠母豬沒有異常的應(yīng)激反應(yīng)，所產(chǎn)仔豬有理想的母源抗體，且在28日齡的中和抗體均維持在1∶32～1∶64之間；相對于不免疫的PEDV陽性母豬來說，免疫接種了的母豬所產(chǎn)仔豬，成活率提高了25%，說明該疫苗是安全且有效的。