葉綠素對(duì)ob/ob肥胖小鼠炎癥指標(biāo)的影響

王 瀟，歐雅文，李媛媛，張 燕

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

肥胖是目前危害人體健康的一大慢性疾病，可引起脂質(zhì)代謝紊亂，如2 型糖尿病、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等，同時(shí)也是引起胰島素抵抗形成的關(guān)鍵因素。肥胖是因能量攝入與消耗不平衡或機(jī)體代謝障礙而導(dǎo)致的代謝異常疾病，由于脂肪組織具有參與機(jī)體代謝的細(xì)胞（如脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞），參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）及豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，這種組織結(jié)構(gòu)給機(jī)體提供了免疫反應(yīng)和代謝反應(yīng)相互作用的適應(yīng)環(huán)境，使這種相互作用尤其對(duì)肥胖的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[1]。

Hotamisligil 等[2]在1993年發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)——腫瘤壞死因子（TNF-α），在脂肪組織中高效表達(dá)，首次認(rèn)識(shí)到炎癥與肥胖的關(guān)聯(lián)性。作為一種低水平的慢性炎癥反應(yīng)，引起這種炎癥反應(yīng)的起始部位主要在脂肪組織，尤其是內(nèi)臟脂肪組織。肥胖引起胰島素抵抗的主要部位也集中在內(nèi)臟脂肪組織，由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α、白介素（IL-6）、瘦素（LEP）等均可作為指示炎性標(biāo)志物[3]。與肥胖相關(guān)的慢性炎癥通常會(huì)出現(xiàn)促炎因子IL-6、TNF-α、瘦素水平明顯上升，抗炎因子脂聯(lián)素、脂肪因子Adipolin 等水平顯著下降等表型特征，這些炎癥因子能夠調(diào)節(jié)脂肪組織和代謝器官間的相互作用。

葉綠素作為膳食綠色蔬菜中重要的非營養(yǎng)性物質(zhì)，廣泛存在于葉綠體類囊體膜上。國內(nèi)外研究表明，葉綠素具有緩解肥胖，抗氧化，調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[4-6]，然而，葉綠素對(duì)炎癥的影響鮮有研究。由于肥胖會(huì)伴隨脂肪組織細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路的激活、炎性細(xì)胞因子的釋放等，因此對(duì)炎癥的干預(yù)可能是研究肥胖及其它代謝問題的基礎(chǔ)。本研究通過對(duì)肥胖小鼠進(jìn)行為期1 個(gè)月的灌胃葉綠素飼養(yǎng)，檢測其炎癥、肥胖基礎(chǔ)指標(biāo)，探究葉綠素對(duì)炎癥的影響，從而進(jìn)一步了解葉綠素發(fā)揮的生物活性作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.），中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

8 周齡ob/ob 小鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。

高脂飼料（Research Diets D12492，251 kJ），美國Research Diets 公司。

1.2 主要試劑

鏈霉親和素、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內(nèi)毒素（ET）、瘦素（LEP）、脂聯(lián)素（ADPN）、ELISA 試劑盒，上海朗頓生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

JYDZ-31B 九陽打漿機(jī)，九陽股份有限公司；CR21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；DHP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，廊坊市中儀國科儀器儀表有限公司；Epoch Acquit 超微量微孔板分光光度計(jì)，美國Biotek 公司；Acquity UPLC 血糖儀，三諾安穩(wěn)傳感有限公司；Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葉綠素的制備 參照Rivera-Chávez 等[7]的方法提取新鮮菠菜中的葉綠素。將洗凈晾干的菠菜葉去梗，置于攪拌機(jī)內(nèi)并倒入適量乙醇（料液比1∶3），攪拌成漿。4 ℃，8 000 r/min 離心6 min，所得上清液在36 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮，獲得葉綠素濃漿，測定葉綠素濃度。移液槍吸取1 mL 葉綠素濃縮液，梯度稀釋100 倍后分別在波長645，663 nm 處測吸光度值，以80%（體積分?jǐn)?shù)）丙酮為對(duì)照。葉綠素水平按式（1）～式（3）計(jì)算。

本試驗(yàn)中，得到葉綠素溶液平均質(zhì)量濃度為7 mg/mL。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組 小鼠均飼養(yǎng)于室溫（23±2）℃，濕度（50±5）%，12 h∶12 h 光暗周期下，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按體重隨機(jī)分成對(duì)照組（NCD）、高脂飲食組（HFD）和葉綠素干預(yù)組（CHL），每組6 只，并分籠飼養(yǎng)，分組方式如表1所示。各組小鼠連續(xù)灌胃4 周，每日灌胃2 次（灌胃飲用水、濃縮葉綠素液以1 mL/100 g 計(jì)算），記錄小鼠每日體重。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Table 1 Experiment design and different treatments

1.4.3 攝食量和空腹血糖的測定 每次檢測24 h 攝食量，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間測1 次，給藥期間測4次（每周1 次）。共測5 次。

測定空腹血糖前要求ob/ob 小鼠禁食24 h，剪尾取血測空腹血糖值。比較ob/ob 鼠血糖值，判斷ob/ob 肥胖小鼠模型是否成功。每周測1 次空腹血糖。

1.4.4 血清中炎癥因子和血清內(nèi)毒素的測定 將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20 倍后備用。小心揭開封板膜，棄去液體甩干，每孔加滿洗滌液靜置30 s 后棄去，重復(fù)5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A，后加入顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min（待測樣品孔混勻于37 ℃溫育60 min后顯色）。加終止液使反應(yīng)終止（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，在加入終止液10 min 內(nèi)，測定450 nm 波長處各孔的吸光度（OD 值）。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將各種試劑移至室溫平衡至少30 min，試劑加樣量見表2。

表2 不同處理組的添加劑量Table 2 Different treatments of dosages

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS Statistics 17 單因素方差分析（ANOVA） 模塊進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 時(shí)，表示差異顯著。采用Origin 9.0（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素對(duì)ob/ob 小鼠血糖、體重及攝食量的影響

表3為不同試驗(yàn)組小鼠在飼養(yǎng)時(shí)間內(nèi)血糖水平、體重及攝食量的變化。由表3可知HFD 組、CHL 組較NCD 組小鼠的血糖水平、體重及攝食量顯著上升（P＜0.05），說明高脂飲食促進(jìn)小鼠血糖的上升，體重的增加及攝食量的增加，與Krebs等[8]研究結(jié)果一致。

在灌胃小鼠葉綠素飼養(yǎng)過程中，HFD 組與CHL 組的3 個(gè)指標(biāo)水平變化無顯著性差異（P＞0.05），說明葉綠素對(duì)肥胖的干預(yù)影響作用可能是一個(gè)長期且緩慢的過程，短時(shí)間內(nèi)對(duì)血糖、體重及攝食量這類表觀指標(biāo)無顯著作用，還需做長期試驗(yàn)。

表3 小鼠血糖、體重、攝食量的變化Table 3 Changes of blood glucose，body weight and food intake in mice

2.2 葉綠素對(duì)肥胖小鼠炎癥指標(biāo)的影響

2.2.1 葉綠素對(duì)TNF-α、IL-6 的影響 TNF-α、IL-6 是由多種細(xì)胞分泌的促炎因子，是反映炎癥程度的重要指標(biāo)。TNF-α 通過激活炎癥細(xì)胞，上調(diào)黏附因子和氧自由基而損害細(xì)胞組織[9]；而IL-6則主要由單核細(xì)胞在炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)下產(chǎn)生，它直接激活炎癥細(xì)胞，并誘導(dǎo)急性期蛋白的合成，催化并放大炎癥反應(yīng)和毒性作用，造成組織細(xì)胞損害[10]。

研究檢測不同分組小鼠血清的TNF-α、IL-6水平，并做組間對(duì)照，結(jié)果如表4所示。HFD 組血清中TNF-α、IL-6 水平較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05），TNF-α 由（124.63±5.96） ng/L 上 升 至（170.57±9.46）ng/L，IL-6 由（110.47±4.12）pg/mL上升至（156.23±8.04） pg/mL，表明高脂飲食會(huì)升高血清中IL-6 水平，與Campbell 等[11]相關(guān)研究結(jié)論一致。而給肥胖小鼠灌胃葉綠素4 周后，小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平顯著下降（P＜0.05），其中TNF-α 水平由（170.57 ± 9.46）ng/L 降至（148.22±6.33）ng/L，IL-6 水平由（156.23±8.04）pg/mL 降至（135.83±5.03）pg/mL，表明葉綠素能有效降低高脂飲食下肥胖小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平。因此，葉綠素可能對(duì)肥胖中的炎癥調(diào)節(jié)有積極影響。

表4 血清中TNF-α、IL-6 水平Table 4 The level of TNF-α and IL-6 in serum

2.2.2 葉綠素對(duì)血清內(nèi)毒素的影響 內(nèi)毒素（ET）被認(rèn)為是肥胖者體內(nèi)全身炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的信號(hào)因子，可由腸道菌群代謝釋放。當(dāng)人體長期處于高脂高糖飲食條件下，腸道菌群會(huì)產(chǎn)生較多內(nèi)毒素。當(dāng)體內(nèi)ET 水平上升時(shí)，導(dǎo)致腸壁上皮細(xì)胞閉合蛋白表達(dá)減少，腸壁通透性增強(qiáng)[12]，ET 可突破腸道屏障由腸道進(jìn)入血液，引起內(nèi)毒素血癥等多種疾病。另外，ET 還能夠活化天然免疫受體（TLR4），介導(dǎo)LPS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起慢性亞臨床炎癥，導(dǎo)致肥胖及胰島素抵抗。ET 刺激肥胖者全血細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6 等促炎因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的初始環(huán)節(jié)[13]。圖1為葉綠素對(duì)內(nèi)毒素的影響，不同試驗(yàn)組之間有顯著性差異。

HFD 組較NCD 組小鼠的血清中ET 濃度顯著升高（P＜0.05），說明高脂飲食會(huì)顯著造成小鼠血清中ET 濃度的上升，與Saad 等[12]的研究結(jié)果一致。給小鼠灌胃葉綠素4 周后，葉綠素干預(yù)了高脂飲食造成的ET 濃度的上升。同時(shí)，在此基礎(chǔ)上，可能ET 濃度下降使得由ET 刺激細(xì)胞因子而產(chǎn)生的TNF-α、IL-6 水平也相應(yīng)下降。Chang 等[14]用靈芝多糖水提物灌胃高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖水提物能顯著降低變形菌門的相對(duì)豐度，從而減輕炎癥，緩解肥胖。有關(guān)葉綠素對(duì)腸道菌群的影響研究表明，葉綠素進(jìn)入小鼠體內(nèi)可顯著降低變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度，產(chǎn)生大量脂多糖[15]。因此，推測葉綠素通過降低變形菌門的相對(duì)豐度，而顯著降低血清中內(nèi)毒素的含量。

2.2.3 葉綠素對(duì)瘦素（LEP）的影響 瘦素（LEP）由脂肪細(xì)胞分泌，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡，促進(jìn)免疫和防治人類心血管疾病等生理、病理等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用[16]。在生物體中，瘦素通常會(huì)受多種因素影響，如胰島素、糖皮質(zhì)激素和TNF-α 等都會(huì)影響其表達(dá)和分泌。當(dāng)機(jī)體觸發(fā)炎癥反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)的LEP 水平升高，相關(guān)免疫因子表達(dá)增加[17]。

本試驗(yàn)檢測了不同試驗(yàn)組小鼠血清的LEP水平，如圖2所示，HFD 組與NCD 組比較，血清中LEP 濃度顯著升高（P＜0.05）。在上述結(jié)果中，研究發(fā)現(xiàn)小鼠血清中TNF-α 水平顯著上升，而TNF-α?xí)龠M(jìn)LEP 的表達(dá)和分泌，因此小鼠血清中LEP水平的上升可能與TNF-α 水平上升有關(guān)。

ob/ob 小鼠葉綠素灌胃干預(yù)4 周后，CHL 組和NCD 組較HFD 組小鼠血清中LEP 水平下降（P＜0.05），說明葉綠素抑制了LEP 的表達(dá)與分泌。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能顯著降低瘦素水平[18]。由于葉綠素可以顯著升高腸道菌群中乳酸菌屬的相對(duì)豐度，因此瘦素水平下降與乳酸菌屬的豐度相關(guān)[15]。

2.2.4 葉綠素對(duì)脂聯(lián)素（ADPN）的影響 圖3表示小鼠血清中脂聯(lián)素（ADPN）質(zhì)量濃度的變化。從圖中可以看出，與NCD 組相比，HFD 組及CHL 組小鼠血清的ADPN 水平均顯著下降（P＜0.05）。ADPN 作為脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽，是胰島素增敏激素，可改善胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化等[19]。同時(shí)，ADPN 水平還可預(yù)測2 型糖尿病、冠心病的發(fā)展，目前臨床研究發(fā)現(xiàn)ADPN具有抗炎癥作用[20]。本研究中CHL 組給ob/ob 小鼠灌胃葉綠素4 周，與HFD 組ob/ob 小鼠相比，葉綠素抑制了由高脂飲食引起的ADPN 水平的下降，有利于降低炎癥的發(fā)生。

圖1 葉綠素對(duì)小鼠血清內(nèi)毒素的影響Fig.1 Effects of chlorophyll on serum endotoxin in mice

圖2 葉綠素對(duì)小鼠血清LEP 的影響Fig.2 Effects of chlorophyll on serum leptin in mice

圖3 葉綠素對(duì)小鼠血清ADPN 的影響Fig.3 Effects of chlorophyll on serum adiponectin in mice

3 結(jié)論

高脂飲食促進(jìn)小鼠血清中TNF-α、IL-6、LEP促炎因子和內(nèi)毒素分泌，抑制ADPN 水平下降；而葉綠素通過抑制體內(nèi)促炎因子與內(nèi)毒素水平升高，促進(jìn)ADPN 水平升高，推測葉綠素可能通過降低炎癥因子水平進(jìn)而影響肥胖的發(fā)生及發(fā)展。由于炎癥因子與腸道菌群密切相關(guān)，因此腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與炎癥因子水平的相關(guān)性，仍需進(jìn)一步探究，從而為葉綠素干預(yù)肥胖的作用機(jī)制提供依據(jù)。