CaSR抑制劑Calhex231通過(guò)PTH-AR途徑參與創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)*

彭小勇， 胡 弋， 薛明英， 李 濤， 劉良明， 楊光明

（陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究部戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400042）

創(chuàng)傷失血性休克在臨床上的發(fā)生率和死亡率均較高，其中一個(gè)引起患者死亡的重要原因是創(chuàng)傷失血性休克后的血管低反應(yīng)性，即復(fù)蘇后血管對(duì)血管活性藥物反應(yīng)減弱甚至不反應(yīng)［1-3］。因此，深入研究血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制并尋找有效的治療措施具有重要意義。鈣敏感性受體（calcium-sensing receptor，CaSR）首先由 Brown 等［4］克隆發(fā)現(xiàn)，屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族成員，主要分布于甲狀旁腺、骨骼、腎臟等器官，其基本功能是維持機(jī)體鈣穩(wěn)態(tài)，還可調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。有研究表明，CaSR 在血管舒縮功能調(diào)節(jié)中也有重要作用［5-6］。我們前期的研究證實(shí)CaSR 抑制劑Calhex231（Cal）可通過(guò)改善休克后血管低反應(yīng)性發(fā)揮對(duì)創(chuàng)傷失血性休克動(dòng)物的保護(hù)作用［7］。但我們也發(fā)現(xiàn)Cal 不是通過(guò)影響全身或血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）內(nèi)外的鈣水平來(lái)發(fā)揮作用，提示有其它機(jī)制參與。

作為最先在甲狀旁腺被發(fā)現(xiàn)的分子，CaSR 對(duì)甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）的合成和分泌有重要調(diào)節(jié)作用［8-9］。PTH 是調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要激素，它可以通過(guò)不同的途徑來(lái)調(diào)節(jié)血壓［10］，且對(duì)成骨樣細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的β-腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）均有調(diào)節(jié)作用［11-12］。AR 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，是一類介導(dǎo)兒茶酚胺作用的組織受體。大量研究證實(shí)，AR失敏是血管低反應(yīng)性的重要機(jī)制之一［13］。那么，CaSR 抑制劑 Cal 改善休克后血管低反應(yīng)性是否與PTH和AR途徑有關(guān)呢？為此，本研究采用創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型及大鼠原代VSMC，觀察Cal 對(duì)休克大鼠血PTH 水平、腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery，SMA）中2 種AR 亞型（α1-AR 和β1-AR）蛋白表達(dá)和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC；VSMC 收縮的關(guān)鍵元件）磷酸化的影響，同時(shí)進(jìn)一步觀察外源給予PTH 對(duì)大鼠血壓和原代VSMC中α1-AR 和β1-AR 蛋白表達(dá)的影響，初步探討CaSR抑制劑Cal 通過(guò)PTH-AR 途徑改善大鼠血管低反應(yīng)性的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和細(xì)胞

健康成年SD 大鼠，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（軍）2017-0058］，雌雄各半，體重（220±20）g。組織貼塊法培養(yǎng)大鼠原代VSMC。

2 主要試劑

平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自ScienCell；胎牛血清購(gòu)自 Gibco；Cal 購(gòu)自 TOCRIS；重組 PTH 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白購(gòu)自Life Science；大鼠PTH ELISA 試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；抗α1-AR 和β1-AR 抗體購(gòu)自Abcam；抗 MLC 和 p-MLC 抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technology；抗β-actin 抗體購(gòu)自Invitrogen；山羊抗兔和抗小鼠熒光Ⅱ抗購(gòu)自Jackson。

3 主要方法

3.1 創(chuàng)傷失血性休克動(dòng)物模型的建立、復(fù)蘇及樣品采集 大鼠于實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食、自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)用30 g/L 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。32只大鼠隨機(jī)分為正常（normal）組、休克（shock）組、休克+乳酸林格氏液（lactated Ringer′s solution，LR）復(fù)蘇組（LR 組）和休克+LR+Cal（1 mg/kg）復(fù)蘇組（LR+Cal 組），行左側(cè)股動(dòng)、靜脈插管以監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）、放血和復(fù)蘇給藥。插管結(jié)束后行右側(cè)股骨骨折，從股動(dòng)脈抽血使血壓降至30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）并維持2 h。模型完成后按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行復(fù)蘇：shock組不予液體復(fù)蘇；LR 組用注射泵按20 mL/h 的速度輸注2 倍失血量的LR；LR+Cal組先給予1倍失血量的LR 輸注，然后把相應(yīng)劑量的Cal 加入另外1 倍失血量的LR 中輸注。復(fù)蘇2 h后通過(guò)股動(dòng)脈抽取全血1 mL，用于檢測(cè)血 PTH 水平，然后取 SMA 用于檢測(cè) α1-AR、β1-AR、MLC及p-MLC蛋白水平。

3.2 血PTH 濃度的檢測(cè) 全血于4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清。預(yù)先取出樣品和試劑盒，平衡至室溫。取出試劑盒板條，設(shè)置樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及空白孔并設(shè)置1 個(gè)復(fù)孔，分別加入50 μL 樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液至各孔，然后每孔加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，用封板膜封好后置于37℃恒溫箱孵育1 h。倒掉各孔液體并在濾紙上拍干，每孔加入300 μL 洗滌液，靜置1 min 后倒掉洗滌液，繼續(xù)在濾紙上拍干，重復(fù)洗板5 次。每孔先后加入50 μL試劑盒底物A、B，37℃恒溫箱孵育15 min，然后加入 50 μL 終止液，15 min 內(nèi)在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度值。

3.3 外源性PTH 對(duì)大鼠血壓的影響 12 只大鼠隨機(jī)分為正常組和休克組。同前插管用于監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓和給予外源性PTH。模型完成后將PTH 按照2 μg/kg 的劑量加入0.2 mL 生理鹽水中靜推，觀察外源給予PTH對(duì)正常和休克大鼠血壓的影響。

3.4 大鼠原代VSMC 的提取與培養(yǎng) 大鼠麻醉后，用碘伏消毒大鼠胸腹部皮膚，取SMA，用無(wú)菌PBS 清洗5 次。剖開(kāi)血管，刮除內(nèi)皮層，剪碎后把組織平鋪在25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清和1%雙抗的平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，先倒置放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中30 min，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。5～7 d 后去組織塊，長(zhǎng)滿后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。選擇3～5 代的VSMC 接種至6 孔板，隨機(jī)分為正常組、PTH 組及PTH+Cal 組，待細(xì)胞融合度80%左右時(shí)，PTH 組用10 nmol/L 的 PTH 處理 2 h，PTH+Cal 組先用 10 nmol/L 的PTH處理2 h，再用10 μmol/L的Cal處理4 h。收集細(xì)胞用于檢測(cè)α1-AR和β1-AR的蛋白表達(dá)水平。

3.5 Western blot 檢測(cè) SMA 和 VSMC 中蛋白表達(dá)取各組SMA 和VSMC，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的 RIPA 在冰上裂解 40 min 后于 4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg 總蛋白，加入loading buffer，干?。?00℃）5 min 使蛋白變性，然后行SDS-PAGE，350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入I 抗（α1-AR，1∶400；β1-AR，1∶800；MLC，1∶1 000；p-MLC，1∶500；β-actin，1∶7 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗5 min×3次，加入熒光標(biāo)記的II 抗（1∶20 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗10 min×3 次，用雙色紅外成像激光系統(tǒng)掃描成像。利用Quantity One 分析軟件讀取各組灰度值，并以β-actin作為內(nèi)參照計(jì)算灰度比值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cal對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠血PTH濃度的影響

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1A）計(jì)算出各組大鼠血PTH濃度，結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克后大鼠血PTH 濃度顯著升高（P＜0.01），LR 組血PTH 濃度繼續(xù)升高，輸注Cal能顯著降低血PTH濃度（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The effect of Cal on blood level of PTH after traumatic hemorrhagic shock in rats.A：linear regression equation；B：blood PTH levels in the rats.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.05 vs LR group.圖1 Cal對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠血PTH濃度的影響

2 Cal 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠SMA 中α1-AR 和β1-AR蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，休克組大鼠SMA 中α1-AR 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），LR 組大鼠SMA 中α1-AR 蛋白表達(dá)水平與休克組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Cal治療后SMA中α1-AR蛋白表達(dá)水平與LR 組比較顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。各組β1-AR蛋白表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2B。

3 Cal對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠SMA中MLC磷酸化水平的影響

休克組大鼠SMA 中p-MLC 水平顯著降低（P＜0.01），LR 組大鼠 SMA 中 p-MLC 水平與休克組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，Cal 組SMA 中p-MLC 水平與LR組比較顯著升高（P＜0.01）；各組MLC蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

4 外源給予PTH 對(duì)正常和創(chuàng)傷失血性休克大鼠MAP的影響

為了進(jìn)一步明確PTH 對(duì)大鼠血壓的影響，我們觀察了外源給予PTH 對(duì)正常和休克大鼠血壓的影響。靜脈推注PTH（2 μg/kg）后，正常組大鼠MAP 顯著降低，降低幅度達(dá)到45.1%，而休克組大鼠血壓也有所降低，降低幅度約為8.8%，見(jiàn)圖4。

5 外源給予PTH 對(duì)大鼠原代VSMC 中α1-AR 和β1-AR蛋白表達(dá)的影響

PTH 處理大鼠原代 VSMC 使 α1-AR 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；而Cal 能拮抗PTH 降低α1-AR蛋白表達(dá)的作用，使α1-AR 表達(dá)水平升高，與PTH 組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5A。各組β1-AR 蛋白表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5B。

Figure 2.The effect of Cal on the protein expression of α1-AR（A）and β1-AR（B）in the SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs normal group；#P＜0.05 vs LR group.圖2 Cal對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠SMA中α1-AR和β1-AR蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of Cal on the phosphorylation level of MLC in the SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs normal group；#P＜0.05 vs LR group.圖3 Cal對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠SMA中MLC磷酸化水平的影響

Figure 4.The effect of exogenous PTH on mean arterial blood pressure（MAP）in normal and traumatic hemorrhagic shock rats.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs before transfusion.圖4 外源給予PTH對(duì)正常和創(chuàng)傷失血性休克大鼠平均動(dòng)脈壓的影響

討 論

休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制主要有受體失敏機(jī)制和VSMC 膜超極化機(jī)制。受體失敏包括AR失敏和血管緊張素受體失敏等。AR 失敏是由缺血等因素引起的受體數(shù)目減少或下調(diào)、親和力降低及與腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)障礙［14］。AR 主要分為 2 個(gè)亞型，包括α-AR（α1-AR 和α2-AR）和β-AR（β1-AR、β2-AR 及β3-AR），其中在心血管系統(tǒng)中分布的主要是α1-AR 和β1-AR。以往研究表明，在人和大鼠外周動(dòng)脈中均有 α1-AR 和 β1-AR 的 mRNA 和蛋白表達(dá)，并且在血管收縮過(guò)程中發(fā)揮重要作用［15-16］。AR 是調(diào)節(jié)VSMC收縮舒張的重要靶點(diǎn)，在失血性休克和膿毒癥休克中都證實(shí)α1-AR 失敏會(huì)導(dǎo)致血管低反應(yīng)性［17-18］。VSMC 收縮主要由MLC 激酶和MLC 磷酸酶對(duì)MLC磷酸化和去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)［19］。MLC 磷酸化水平是VSMC 中收縮力生成的決定因素，AR 可通過(guò)調(diào)節(jié)MLC 激酶進(jìn)而影響 MLC 磷酸化水平［20］。那么 Cal 改善創(chuàng)傷失血性休克后血管低反應(yīng)性的機(jī)制是否通過(guò)AR調(diào)節(jié)MLC磷酸化水平而發(fā)揮作用，且通過(guò)哪個(gè)亞型呢？我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克后大鼠SMA 中α1-AR 表達(dá)顯著降低，Cal 能顯著提高α1-AR 蛋白表達(dá)水平，而各組大鼠SMA 中β1-AR 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。同時(shí)，創(chuàng)傷失血性休克后血管組織的MLC 磷酸化水平顯著降低，而Cal 可顯著提高M(jìn)LC 磷酸化水平，提示Cal可能通過(guò)上調(diào)α1-AR 表達(dá)、增加MLC 磷酸化水平來(lái)改善血管低反應(yīng)性。那么，Cal是如何調(diào)節(jié)α1-AR呢？

Figure 5.The effect of exogenous PTH on the expression of α1-AR（A）and β1-AR（B）in rat primary VSMC.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs normal group；#P＜0.05 vs PTH group.圖5 外源給予PTH對(duì)大鼠原代VSMC中α1-AR和β1-AR蛋白表達(dá)的影響

CaSR 首先在甲狀旁腺中被克隆，PTH 是由甲狀旁腺分泌的一種重要的鈣磷調(diào)節(jié)激素［21］，其基本作用是通過(guò)骨化三醇調(diào)節(jié)胞外Ca2+濃度。CaSR 可通過(guò)感受血鈣濃度作用于甲狀旁腺，對(duì)血PTH 水平的調(diào)控起關(guān)鍵作用［9］。現(xiàn)有研究表明，PTH 與血壓和血管收縮舒張有重要的關(guān)聯(lián)，并在不同的疾病模型中發(fā)揮不同的作用。例如，它在原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者中可以增加血鈣濃度而升高血壓；在慢性腎病患者中，它可以通過(guò)激活腎素-血管緊張素-醛固酮信號(hào)途徑促進(jìn)水鈉重吸收來(lái)增加血容量進(jìn)而升高血壓［22-23］。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，間歇性地給予小鼠注射PTH 可刺激骨皮質(zhì)并引起血管舒張［24］；外源性PTH 還可以拮抗血管對(duì)去甲腎上腺素和血管緊張素的升血壓效應(yīng)［25］。一項(xiàng)對(duì)46 名創(chuàng)傷患者的研究顯示，創(chuàng)傷失血性休克病人血中PTH 水平顯著提高［21］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到創(chuàng)傷失血性休克大鼠血PTH水平顯著增高，那么PTH 是否與休克后的低血壓有關(guān)？為此，我們觀察了給予外源性PTH 對(duì)正常和休克大鼠血壓的影響，結(jié)果顯示，外源性PTH 能顯著降低正常大鼠血壓，也使休克大鼠血壓輕度降低。我們推測(cè)這種現(xiàn)象可能與休克后大鼠血壓本身較低和血PTH濃度本身較高有關(guān)?？紤]到文獻(xiàn)報(bào)道PTH可通過(guò)β-AR 調(diào)節(jié)心肌的收縮功能［12］。我們進(jìn)一步觀察了外源性 PTH 對(duì) Cal 調(diào)節(jié) VSMC 中 AR 作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTH 處理大鼠原代VSMC 使α1-AR蛋白表達(dá)降低，Cal 能夠拮抗PTH 的這種作用，提示Cal可能通過(guò)PTH來(lái)調(diào)節(jié)AR表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克后Cal 可通過(guò)降低血PTH 濃度、上調(diào)血管α1-AR 蛋白表達(dá)水平、升高VSMC 中MLC 磷酸化水平而發(fā)揮改善休克后血管低反應(yīng)性的作用。