載10-羥基喜樹堿靶向相變納米粒聯(lián)合高強度聚焦超聲治療裸鼠肝癌移植瘤

任春蓉 張戰(zhàn)峰 陳春燕 魏小芳 周 洋

高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）作為最具代表性的非侵入性治療腫瘤的方式之一，應(yīng)用前景廣泛，但其治療深部腫瘤（如肝癌）時需增加超聲功率或延長單次消融時間，且其療效和生物安全性降低，嚴(yán)重阻礙了其在臨床的進一步發(fā)展應(yīng)用［1］。相關(guān)研究［2-3］應(yīng)用超聲增效劑改變組織的聲環(huán)境、增加超聲空化作用和能量沉積來增效HIFU 治療。其中相變超聲造影劑通過靜脈注射后再行HIFU 輻照，可在腫瘤原位相變產(chǎn)生微泡，增效HIFU 的同時監(jiān)控HIFU消融過程，取得了較好的效果。然而，HIFU消融不可避免存在殘余腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時因HIFU 消融可破壞腫瘤血管致化療藥物難以到達腫瘤［4-5］。本實驗擬制備一種葉酸受體靶向的載10-羥基喜樹堿相變納米粒（folic acid receptortargeted 10-hydroxycamptothecin -loaded phase-change nanoparticle contrast agent，F(xiàn)R-HCPT-PNPCA），可以在增效HIFU 消融的同時釋放化療藥物，旨在更好地殺滅腫瘤細(xì)胞，增強遠期療效，為腫瘤精準(zhǔn)治療提供一種新的手段。

材料與方法

一、實驗動物

BALB/c 裸鼠 160 只，3～5 周齡，平均體質(zhì)量（20.1±2.2）g，購于西南交通大學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗均取得西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會同意。

二、儀器與試劑

1.主要試劑和細(xì)胞：磷脂酰膽堿（DPPC）、偶聯(lián)葉酸的磷脂酰乙醇胺［DSPE（PEG）Folate］、普通磷脂酰乙醇胺（DSPE）、甘油磷脂（DPPG）、泊洛沙姆（PF68）及膽固醇（CH）購于美國Avanti 公司，全氟己烷（PFH）購于法國Elf Atochem 公司，末端標(biāo)記測定法（TUNEL法）檢測細(xì)胞凋亡和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體購于美國 Sigma 公司，10-HCPT、三氯甲烷、甲醛及 TTC 染色試劑購于生工生物工程（上海）有限公司。人肝癌7721 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。

2.實驗儀器：78-1 磁力攪拌器（上海越磁電子科技有限公司），RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)J-200 高速分散均質(zhì)機（上海隆拓儀器有限公司），VCX-130 超聲破碎儀（美國SONIC 公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），MyLab 90 彩色多普勒超聲診斷儀（意大利百勝醫(yī)療），JC-A HIFU 治療儀（重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司）。

三、FR-HCPT-PNPCA 的制備

HIFU 消融前 1 d 參照本課題組前期研究［6-7］的方法，將殼材［DPPC、DSPE（PEG）Folate/DSPE、DPPG、PF68、CH 和10-HCPT］按5∶1∶1∶1∶1∶1 的比例用三氯甲烷、甲醛溶解，加入后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，重新水化后加入PFH 經(jīng)過雙步乳化制得乳白色的FR-HCPTPNPCA 乳劑。不加入10-HCPT 則制得單純靶向非載藥相變納米粒（FR-PNPCA）乳劑，成品送西南交通大學(xué)材料學(xué)院測得乳劑平均粒徑（340±45）nm，濃度1.12×1010個/ml。

四、荷瘤裸鼠模型建立及分組

1.荷瘤裸鼠模型建立及分組：選取160 只BALB/c裸鼠，采用皮下注射人肝癌7721細(xì)胞的方法建立荷瘤裸鼠模型，3～4 周后選取腫瘤大小約1 cm×1 cm×1 cm荷瘤裸鼠120 只，隨機等分為4 組，于HIFU 治療前1 d分別通過尾靜脈注射藥物或生理鹽水200 μl。A 組為注射生理鹽水后行HIFU 輻照，B 組為注射HCPT（2 mg/ml）后行 HIFU 輻照，C 組為注射 FR-PNPCA 后行 HIFU 輻 照 ，D 組 為 注 射 FR-HCPT-PNPCA 后 行HIFU輻照。

2.HIFU 治療：參照既往實驗研究［2-3］方法，裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，固定四肢，將腫瘤部位完全浸入HIFU 治療儀的脫氣水槽中，超聲確定焦域位于腫瘤中心，采用點輻照的方式進行消融治療，能量為120 W，作用時間5 s。

五、觀察指標(biāo)

1.HIFU 輻照后即刻應(yīng)用超聲（LS 22 探頭，頻率3～7 MHz）觀察各組腫瘤內(nèi)灰度變化，手動勾畫出變化明顯區(qū)域，儀器自動計算灰度變化值和灰度變化面積。

2.輻照后2 h 觀察大體病理和藥物濃度。每組均處死10 只裸鼠，取腫瘤組織行TTC 染色先肉眼觀察，后組織切片行HE 染色于顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞壞死情況。然后腫瘤組織作組織勻漿，高效液相色譜檢測各組瘤內(nèi)HCPT濃度。

3.輻照后48 h 行免疫組化檢測腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況。每組再處死10 只裸鼠，取腫瘤組織切片行PCNA 和TUNEL 染色。顯微鏡下人工計數(shù)視野下染棕黃色細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞增殖率和凋亡率。

4.輻照后2 周觀察腫瘤的生長和遠處轉(zhuǎn)移情況。處死各組剩余裸鼠，測量腫瘤大小，并取主要臟器觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD 法；非正態(tài)分布的計量資料比較行Mann-WhitneyU秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組腫瘤灰度變化比較

HIFU輻照后即刻，超聲示A、B組輻照區(qū)域幾乎無灰度變化，C、D組均見明顯灰度變化，其灰度變化面積和變化值與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；C、D組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1和表1。

二、各組瘤內(nèi)藥物濃度比較

圖1 各組裸鼠腫瘤HIFU輻照前后超聲圖像

表1 各組腫瘤觀察指標(biāo)比較（）

表1 各組腫瘤觀察指標(biāo)比較（）

與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，*P＜0.05

組別A組B組C組D組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量（個）12.51±3.25 10.87±3.43 4.42±2.27 3.14±1.66#*△灰度變化面積（mm2）5.43±2.28 5.68±2.45*113.52±14.17#115.43±13.73#灰度變化值（IU）7.23±3.79 7.96±4.04*74.49±17.15#73.77±16.94#凝固性壞死體積（mm3）0 0*258.88±28.21#263.74±32.86#細(xì)胞增殖率（%）63.77±11.43 64.58±10.76*46.44±7.82#37.49±6.97#*細(xì)胞凋亡率（%）8.31±2.45 8.79±2.77*36.39±5.15#51.06±8.73#*腫瘤體積（mm3）1.75±0.38 1.48±0.45*0.65±0.22#0.31±0.14#*

A、C組腫瘤組織勻漿內(nèi)均未測得HCPT，B、D組測得HCPT濃度分別為（0.50±0.14）mg/ml、（1.20±0.42）mg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

三、病理結(jié)果比較

1.大體病理：輻照后2 h，A、B 組腫瘤內(nèi)均無明顯凝固性壞死，呈均勻紅色；C、D組腫瘤內(nèi)均可見明顯凝固性壞死，邊界清楚，呈灰白色，C、D 組壞死范圍與A、B組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。輻照后2周，A、B 組腫瘤體積均明顯增大，與C、D 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組均見不同部位（肝、腹腔、肺、腦）的腫瘤轉(zhuǎn)移，A、B、C、D 組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量分別為（12.51±3.25）個、（10.87±3.43）個、（4.42±2.27）個、（3.14±1.66）個，D 組與A、B、C 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1和圖2。

2.組織病理：輻照后2 h，病理示C、D 組靶區(qū)細(xì)胞大片壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，呈不規(guī)則紅色，與未壞死的腫瘤細(xì)胞邊界清楚。輻照后24 h，免疫組化示D 組增殖率最低，凋亡率最高，與A、B、C 組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

圖2 各組裸鼠腫瘤HIFU輻照后大體圖

圖3 裸鼠腫瘤HIFU消融后病理圖（×400）

討 論

HIFU通過聚焦超聲能量來消融和破壞腫瘤組織，已應(yīng)用于臨床原發(fā)性實體瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療。然而，在面對位置較深、體積較大的腫瘤（如肝癌、胰腺癌等）時，由于沿超聲途徑的能量快速衰減，治療效果欠佳，限制了其臨床應(yīng)用。研究［3］證實微泡可以改變組織的聲環(huán)境，通過增加超聲空化作用可增強HIFU消融的效果，但其受微泡不穩(wěn)定、循環(huán)時間短、粒徑大等因素影響，尤其作為血池顯影劑，其在增效HIFU 的同時可能導(dǎo)致能量在焦域近場沉積，甚至因壞死區(qū)變形成為近大遠小的“蝌蚪形”，從而導(dǎo)致消融灶不可控，可能存在焦點前加熱和周圍組織損傷。在此背景下，基于各種納米系統(tǒng)的相變超聲造影劑應(yīng)運而生［1-4］，廣泛應(yīng)用于HIFU增效。經(jīng)靜脈注射后，相變造影劑粒徑足以通過血管內(nèi)皮間隙在腫瘤組織內(nèi)存留，在HIFU 能量作用下，其可在靶區(qū)原位產(chǎn)生微泡，增加HIFU 能量沉積，降低HIFU 作用功率、縮短治療時間、增加消融范圍，最終達到增強HIFU 治療效果，且此“從小到大、原位相變”的策略還有利于避免微泡增效HIFU 引起焦點外損傷的缺陷［1，3］。本實驗所用 HIFU能量為120 W，作用時間為5 s，這一能量不足以消融腫瘤，故A、B 組輻照后腫瘤并無灰度變化和細(xì)胞凝固性壞死，而注射了靶向相變造影劑的C、D 組輻照后均提示腫瘤灰度變化和細(xì)胞凝固性壞死。

為了增加相變納米粒在腫瘤細(xì)胞周圍的蓄積以增效HIFU，包載具有主動靶向能力的葉酸受體相變納米粒是可供選擇的方式之一。本課題組前期研究［6-7］中制備了包載10-HCPT 的葉酸受體靶向相變造影劑，并證實其能夠較好地黏附在腫瘤細(xì)胞周圍。本課題組另一研究［3］也發(fā)現(xiàn)葉酸受體靶向的相變造影劑可在腫瘤內(nèi)靶向沉積，與非靶向的相變造影劑相比，HIFU消融后腫瘤壞死范圍增大，腫瘤細(xì)胞增殖率降低而凋亡率升高。但無論采取何種增效方式，HIFU消融后腫瘤殘余、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移均是難以避免的問題［2，8-9］。

本實驗制備的靶向載藥相變納米粒FR-HCPTPNPCA，將基于超聲靶向破壞微泡技術(shù)［10］的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)融入HIFU 消融和增效中，結(jié)果顯示，D 組腫瘤內(nèi)FR-HCPT-PNPCA 沉積，在HIFU 輻照后可破壞微泡定向釋放HCPT，不僅消融范圍擴大、腫瘤細(xì)胞增殖率最低、凋亡率最高，且腫瘤生長緩慢、轉(zhuǎn)移灶最少，由此可見該方法對腫瘤的遠期療效最好。A 組為生理鹽水+HIFU 輻照，既往研究［3］表明，低劑量 HIFU輻照不足以引起腫瘤細(xì)胞明顯壞死。B 組為注射HCPT+HIFU 輻照，治療效果欠佳，C 組 HIFU 輻照后即刻腫瘤灰度變化和壞死體積與D組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但輻照2 周后療效低于D 組（P＜0.05）。究其原因可能為：①HIFU 能量低，HCPT 溶液不能增效HIFU；②注射的HCPT 單體容易通過代謝清除，可能降低抑瘤效果；③靶向相變造影劑有利于增加HIFU能量在靶區(qū)沉積，故輻照后短時間內(nèi)C、D 組效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗中D 組的腫瘤組織HCPT 濃度高于B 組（P＜0.05），原因為納米材料在腫瘤蓄積，在HIFU 作用下，既發(fā)生了相變（靶區(qū)灰度變化證實），又破壞相變微泡釋放HCPT（瘤內(nèi)藥物濃度證實），達到了超聲靶向破壞微泡聯(lián)合腫瘤靶向給藥的作用，C、D 組間腫瘤細(xì)胞增殖率和凋亡率的差異也能解釋兩組間遠期療效的差異，但其相關(guān)機制和最佳釋放藥物條件（如持續(xù)輻照或者間歇輻照、輻照時間的優(yōu)化等）有待今后進一步研究。

本實驗的局限性：僅在既往研究［3］結(jié)果證實的基礎(chǔ)上應(yīng)用同一劑量進行HIFU 消融，未針對不同能量、時間、消融方式等進行分組，待以后進一步研究以確定更有效地消融和釋放藥物，獲得最佳的治療效果。

綜上所述，本實驗制備的FR-HCPT-PNPCA 既是一種高效的HIFU 增效劑，又是一種協(xié)同HIFU 消融的靶向藥物，二者聯(lián)合能顯著增強HIFU 的消融療效和生物安全性，有望為腫瘤治療提供一種精準(zhǔn)、高效的手段。