指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價擬草果質(zhì)量的研究

馮 軍，柴 玲，陳明生，袁健童，劉布鳴

廣西中醫(yī)藥研究院 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022

擬草果又稱白草果、廣西草果，為姜科豆蔻屬植物擬草果Amomum paratsao-koS.Q.Tong et Y.M.Xia 的干燥成熟果實，主產(chǎn)于廣西、云南等省區(qū)，在廣西主產(chǎn)地為那坡縣壯族集居地，靖西、隆林等地也有分布[1-2]。在廣西民間常作草果A.tsao-koCrevost et Lemarie的代用品用作提香或者藥用，為常用壯藥，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第三卷》，用于寒濕內(nèi)阻、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉等癥[3]，其中含量測定項僅以總揮發(fā)油含量控制藥材質(zhì)量，尚無具體化學(xué)成分的含量測定標(biāo)準(zhǔn)。目前，對擬草果有少量的研究報道[4-7]，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于擬草果質(zhì)量評價相關(guān)的研究報道。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，擬草果中含有多種黃酮類成分[4]，其中鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4’-二甲氧基黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)類似。鼠李檸檬素含量較高，其他2 個成分含量較低且市售對照品價格昂貴。本研究擬建立擬草果指紋圖譜并采用一測多評（QAMS）法同時測定擬草果中鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮的含量，以期為擬草果藥材的質(zhì)量評價提供方法參考。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀（美國，含四元梯度泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD 檢測器），梅特勒XS-205 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

擬草果分別采自廣西那坡縣（批號150907、150908、160828、160829）、隆林縣（批號170909、170910、181009、181010）、靖西市（批號190912、190913），編號依次為S1～S10。經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為姜科豆蔻屬植物擬草果A.paratsao-koS.Q.Tong et Y.M.Xia 的干燥成熟果實；鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4’-二甲氧基黃酮為自制對照品，經(jīng)光譜結(jié)構(gòu)確定HPLC 峰面積歸一化法計算，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。乙腈、甲醇（Fisher 公司）為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～10 min，30%乙腈；10～65 min，30%～90%乙腈；平衡時間15 min；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；DAD 雙通道檢測，檢測波長300、366 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.060、0.204、0.092 mg/mL 的對照品母液，分別精密吸取對照品母液1、2.5、5 mL 至10 mL 量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮質(zhì)量濃度分別為 30.0、51.0、9.2 μg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取擬草果粉末（過40目篩）約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取（64 ℃）1 h，取出，放冷，用甲醇補足質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（批號150907）10 μL，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以鼠李檸檬素為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于1.5%，6 次進(jìn)樣指紋圖譜相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液（批號150907）10 μL，在“2.1”項色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以鼠李檸檬素為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3%，6 個時間點采集的指紋圖譜相似度均大于0.98，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取擬草果樣品（批號150907）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項色譜條件分析，記錄色譜圖，以鼠李檸檬素為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3%，6 份樣品的指紋圖譜相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 分別取10 個批次擬草果樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品，在“2.1”項下色譜條件分析，記錄色譜圖，圖譜按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004年版）分析，自動匹配確立15 個共有峰，與混合對照品保留時間對比，共確認(rèn)3 個成分，分別是鼠李素（2 號峰）、鼠李檸檬素（6 號峰）、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮（9 號峰），采用平均值法生成對照指紋圖譜。結(jié)果10 批次樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜（R）相似度分別為0.997、0.997、0.997、0.997、0.937、0.968、0.989、0.989、0.992、0.993，均大于0.9。10 批擬草果樣品指紋圖譜見圖1，對照指紋圖譜見圖2，混合對照品圖譜見圖3。

2.3.5 共有峰相對保留時間及相對峰面積計算鼠李檸檬素峰保留時間適中，峰形較好且峰面積較大，選擇作為參考峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表1、2。

圖1 10 批擬草果樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of ten batches of A.paratsao-ko samples

圖2 對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint

圖3 混合對照品HPLC 色譜圖Fig.3 Chromatogram of reference substances

2.4 QAMS 法定量分析

2.4.1 色譜條件及樣品制備同“2.1”“2.2.1”“2.2.2”項下方法。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取系列濃度的混合對照品溶液10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），得鼠李素回歸方程：Y＝3 007.3X＋0.577，r＝0.999 99；鼠李檸檬素回歸方程：Y＝3 928.5X－4.7861，r＝0.999 99；3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮回歸方程：Y＝4 473.9X－2.65，r＝0.999 99。結(jié)果表明：擬草果中鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮進(jìn)樣量分別在0.06～0.60、0.102～1.020、0.018 4～0.184 0 μg，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 10 批樣品共有峰相對保留時間Table 1 Relative retention time of common peaks of 10 batches of samples

表2 10 批樣品共有峰相對峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks of 10 batches of samples

2.4.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL 進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮峰面積的RSD值分別為0.14%、0.13%、0.15%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號150907），分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮峰面積的 RSD 值分別為0.41%、0.41%、0.44%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一批（批號150907）擬草果樣品6 份，每份約1 g，精密稱定，按“2.2”項供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結(jié)果鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮含量分別為1.25、2.42、0.40 mg/g，RSD 值分別為0.57%、0.61%、0.67%，說明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已測定的擬草果（批號150907）粉末（過40 目篩）約0.5 g，精密稱定，平行稱取9 份，置具塞錐形瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)品與供試品含量比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1 分別加入各標(biāo)準(zhǔn)品，每個比例配置3 份，分別精密加入50 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，回流提?。?4 ℃）1 h，取出，放冷，用甲醇補足質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。各供試品溶液進(jìn)樣體積10 μL，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮平均回收率分別為 100.31%、100.23%、100.63%，RSD 分別為0.97%、1.44%、1.11%，結(jié)果表明方法回收率良好。

2.4.7 相對校正因子（f）的測定 分別吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，測定各成分的峰面積和保留時間，根據(jù)文獻(xiàn)研究方法[8-9]，分別計算鼠李素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮與內(nèi)參物鼠李檸檬素的f及相對保留值，結(jié)果f鼠李檸檬素/鼠李素＝1.300、f鼠李檸檬素/3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮＝0.885，RSD 分別為0.20%、0.44%。

2.4.8 樣品測定 分別取10 個批號擬草果樣品，按“2.2.2”項供試品溶液制備供試品，在“2.1”項色譜條件下測定，采用外標(biāo)法（EMS）與QAMS法分別對擬草果中的3 種黃酮類成分含量進(jìn)行測定，結(jié)果2 種方法測定的結(jié)果基本一致，采取QAMS 法測定擬草果中鼠李素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮的含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的確定

采用DAD 檢測器采集供試品溶液的三維光譜圖，結(jié)果顯示，鼠李素、鼠李檸檬素、3,5-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮紫外吸收特征相似，均在366 nm處有最大吸收，而在300 nm 處其他特征組分具有較好吸收，故選擇雙波長法同時測定指紋圖譜及3種成分的含量。

表3 QAMS 法與EMS 法測定擬草果中3 種成分的含量Table 3 Contents of three compositions of A.paratsao-ko determined by QAMS and EMS

3.2 供試品制備方法的考察

經(jīng)對比超聲和回流2 種提取方法，結(jié)果顯示，2 種方法提取色譜圖基本一致，但回流法提取效率更高，故選擇回流提取。進(jìn)一步考察提取溶劑、溶劑用量以及提取時間等參數(shù)，最終確定上述本實驗供試品制備方法。

3.3 方法應(yīng)用

采用本實驗建立的方法，對不同批次的擬草果和草果分別進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，二者特征圖譜有明顯差異，擬草果中含有的黃酮類成分群均未在草果中檢出。廣西民間常將擬草果作為草果的代用品，主要是利用其含有的揮發(fā)油成分起提香作用，而作為臨床藥用時則不宜用于替代草果。

4 結(jié)論

QAMS 法結(jié)合指紋圖譜技術(shù)，既發(fā)揮QAMS法簡便、易行、經(jīng)濟的優(yōu)點，又體現(xiàn)指紋圖譜整體、全面的優(yōu)勢。指紋圖譜與含量測定采用同一方法，簡化了分析過程，降低分析成本。所建立的方法同時達(dá)到定性、定量2 個目的，可作為擬草果藥材的質(zhì)量評價方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突