UPLC測(cè)定經(jīng)典名方金水六君煎中11種成分

董自亮，李紅亮，原歡歡，蔣燕霞，李 娟，禹奇男，吳瑞軍，冉亞東，安太勇，覃 瑤，彭世陸，劉世琪，彭 濤，秦少容，羅維早*，王 欣*

1.重慶市中藥研究院，重慶 400065

2.太極集團(tuán)有限公司，重慶 400800

金水六君煎（Jinshui Liujun Decoction，JLD）出自明·張介賓《景岳全書》，為國(guó)家中醫(yī)藥管理局2018年公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》的經(jīng)典名方的第58 首。原文：“當(dāng)歸二錢，熟地三五錢，陳皮一錢半，半夏二錢，茯苓二錢，炙甘草一錢，水二鐘，生姜三五七片，煎七八分，食遠(yuǎn)溫服”。方中半夏辛溫，能燥濕化痰、和中止嘔；陳皮芳香，理氣運(yùn)脾、燥濕化痰；茯苓甘淡，甘能補(bǔ)脾，淡可滲濕，使已聚之濕從小便滲利而去，更添甘草和中益脾，共奏理氣健脾、燥濕化痰之效。主治肺腎虛寒、水泛為痰、或年邁陰虛、血?dú)獠蛔?、外受風(fēng)寒、咳嗽嘔惡、喘逆多痰等癥[1]。近年來對(duì)該方的藥效學(xué)研究較多，但對(duì)其化學(xué)成分的研究及定量測(cè)定報(bào)道較少。文獻(xiàn)僅報(bào)道采用HPLC 對(duì)JLD 制劑中陳皮（橙皮苷）、當(dāng)歸（阿魏酸）藥材進(jìn)行定量測(cè)定[2-3]，以及采用薄層掃描法、紫外分光光度法測(cè)定JLD 膠囊中β-谷甾醇和總生物堿的含量[4]，但未能全面有效地控制該復(fù)方制劑的多種成分。本研究采用UPLC 技術(shù)[5-6]，首次建立了多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定JLD 中腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯11 種主要成分的UPLC 方法，此方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，同時(shí)結(jié)合偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）等化學(xué)識(shí)別模式[7]，評(píng)價(jià)各批次樣品之間的質(zhì)量差異，在此基礎(chǔ)上為Hotelling’sT2和DModX 2 種統(tǒng)計(jì)量設(shè)定了控制限和警戒限，為JLD 物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的研究及其后續(xù)現(xiàn)代制劑質(zhì)量的全面控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290-UPLC DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；XSE205DU 型電子天平，精密度0.01 mg/0.1 mg，Mettler Toled 公司；LGJ-10FD 型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；KQ-500DE 超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料

JLD，實(shí)驗(yàn)室自制；對(duì)照品腺苷（批號(hào)110879-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、鳥苷（批號(hào)111977-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.6%）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)111626-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）、6-姜辣素（批號(hào)111833-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)111737-201910，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品蕓香柚皮苷，批號(hào)18040301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.66%，購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。乙腈、磷酸均為色譜純，北京化標(biāo)源科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

JLD 中各飲片均采自3 個(gè)產(chǎn)地，按《中國(guó)藥典》2015年版一部項(xiàng)下檢測(cè)均合格。產(chǎn)地、批次等具體信息見表1。經(jīng)重慶市中藥研究院羅維早研究員鑒定，各飲片均符合《中國(guó)藥典》2015年版一部相關(guān)項(xiàng)下的性狀規(guī)定，鑒定結(jié)果地黃為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch 的新鮮或干燥塊根，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根，陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘Citrus reticulataBlanco 的干燥成熟果皮，半夏為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRose.的新鮮根莖。

表1 15 批次JLD 樣品各批次中所用飲片的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of decoction pieces used in each batch of 15 batches of JLD samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為Acquity UPLC HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，100% A；2～7 min，100%～98% A；7～12 min，98% A；12～25 min，98%～90.5% A；25～32 min，90.5%～85.5% A；32～41 min，85.5% A；41～50 min，85.5%～79% A；50～58 min，79%～71% A；58～64 min，71%～44%A；64～70 min，44%～35% A；70～71 min，35%～5% A；72 min，5% A；72～73 min，5%～100% A；體積流量0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm（0～17 min、64～66 min）、330 nm（18～40 min）、281 nm（40～64 min、66～73 min）切換；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。各峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

圖1 空白溶劑 (A)、混合對(duì)照品溶液 (B)、供試品溶液 (C)UPLC 圖Fig.1 UPLC of blank (A),standard solution (B) and sample solution (C)

精密稱取腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇溶解后配制成質(zhì)量濃度分別為40.12、69.16、738.80、39.88、193.80、58.75、164.60、421.80、218.90、134.90、25.20 μg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備

采用隨機(jī)數(shù)表法，分別對(duì)熟地黃、當(dāng)歸、陳皮、半夏、茯苓、炙甘草、生姜各15 批飲片進(jìn)行編號(hào)及排序。根據(jù)原方記載及本方考證的劑量折算關(guān)系，稱取一個(gè)處方量的JLD（當(dāng)歸7.46 g、熟地黃14.92 g、陳皮5.60 g、半夏7.46 g、茯苓7.46 g、炙甘草3.73 g、生姜15 g），加水400 mL，加熱至沸騰轉(zhuǎn)小火，保持沸騰30～60 min，濾過，濾液冷凍干燥（-50 ℃干燥72 h，5 Pa），即得JLD 干粉。

取本品約0.5 g，加70%甲醇15 mL，置于密塞錐形瓶中，精密稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取1、2、3、5、10、20 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液；按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見表2。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為1.26%、1.45%、1.06%、0.17%、0.95%、1.43%、0.86%、1.24%、0.23%、1.26%、0.95%。11 種成分峰面積的RSD 值均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 份批號(hào)為S1 的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于第0、6、12、18、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為1.92%、2.68%、0.98%、1.18%、0.90%、1.23%、0.51%、1.43%、0.85%、1.55%、0.95%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11 種成分峰面積的RSD 值均小于3.0%，表明JLD 供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 11 種成分的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation,linear range and correlation coefficient of 11 active ingredients

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取JLD 樣品（批號(hào)為S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為2.88%、1.69%、2.35%、0.95%、0.53%、1.05%、0.56%、1.85%、0.40%、0.36%、1.81%，11 種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值均小于3.0%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的JLD樣品（批號(hào)為S1），稱取約0.25 g，精密稱取6 份，分別加入約為樣品中等量的各對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分質(zhì)量濃度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別97.70%、103.15%、100.71%、97.79%、99.74%、102.72%、96.62%、101.43%、102.35%、97.65%、98.11%，RSD 值分別為0.78%、1.67%、1.04%、0.50%、1.60%、0.68%、0.98%、0.56%、0.19%、1.54%、0.23%。

2.5 樣品測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下樣品處理方法，制備15 批供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算JLD 中腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表3 15 批JLD 樣品中11 種成分測(cè)定結(jié)果Table 3 Content of 11 components in 15 batches of JLD

2.6 PLS-DA 模型的建立及相關(guān)分析

采用 SIMCA 14.1 軟件（Umetrics，MKS Instruments Inc.，Sweden）對(duì)15 批JLD 樣品中的多指標(biāo)含量測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）。應(yīng)用Hotelling’sT2和DModX 2 種控制圖對(duì)不同批次的樣品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)而采用有監(jiān)督的PLS-DA 模型進(jìn)行分析。

2.6.1 Hotelling’sT2和 DModX 控制限的建立Hotelling’sT2和DModX 控制圖是為了監(jiān)測(cè)不同批次產(chǎn)品而開發(fā)的，是2 個(gè)互補(bǔ)的多變量分析手段。Hotelling’sT2表示的是每個(gè)選定觀察點(diǎn)與模型平面中原點(diǎn)的距離，為模型的內(nèi)部變化度量，代表樣品中信息與主成分模型中其他樣品差異；DModX 表示數(shù)據(jù)在變量X空間到主成分模型的距離，為模型外部的數(shù)據(jù)變化度量，代表樣品中未被模型解釋的變化。通常認(rèn)為在控制限度以下的產(chǎn)品為正常批次產(chǎn)品，超出控制限的為異常批次樣品。Hotelling’sT2和DModX 統(tǒng)計(jì)量作為批間差異性評(píng)價(jià)指標(biāo)，兩者具有不同的監(jiān)控作用，互為補(bǔ)充。當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個(gè)批次超出或控制限時(shí)，在貢獻(xiàn)圖上可以分析批次過程的異常波動(dòng)受哪些變量的影響[8]。

Hotelling’sT2和DModX 的控制圖如圖2、3，圖中的T2Crit (99%)和DCrit 為控制限，其控制上限分別為14.43 和1.75；T2Crit (95%)為警戒限，上限為8.20。這15 批物質(zhì)基準(zhǔn)樣品在控制限之下，均為正常批次產(chǎn)品，在2 張控制圖上處于受控狀態(tài)，這也證明所建立的PCA 模型較好的表征了樣品的正常波動(dòng)。說明這15 批物質(zhì)基準(zhǔn)樣品批次質(zhì)量差異性較好，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，并且較于相似度閾值解釋性更強(qiáng)。

2.6.2 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 為評(píng)價(jià)不同批次JLD 樣品之間的成分含量差異，采用有監(jiān)督的PLS-DA 模型進(jìn)行分析[9]。以樣品S1～S15 為Y變量，11種成分的含量為X變量，利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA 處理，見圖4、5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在置信區(qū)間（95%）內(nèi)，15 批樣品存在一定差異性，根據(jù)分布可將樣品S1～S15 分為3 類，樣品S1～S5為一類，S6～S10 為一類，S11～S15 為一類，表明這11 種成分在評(píng)價(jià)樣品產(chǎn)地之間的質(zhì)量差異具有重要參考價(jià)值。同時(shí)，變量重要性投影（VIP）值越大，表明對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)較大；其中VIP＞1 的有4 種成分，依次為蕓香柚皮苷、甘草酸銨、藁本內(nèi)酯和阿魏酸，說明這4 種成分是影響不同批次樣品之間質(zhì)量差異貢獻(xiàn)較大的成分，可作為指導(dǎo)經(jīng)典名方JLD 物質(zhì)基準(zhǔn)及復(fù)方制劑質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分。

圖2 15 批JLD 樣品Hotelling’s T2 控制圖Fig.2 Hotelling’s T2 control chart of 15 batches of JLD

圖3 15 批JLD 樣品的DModX 控制圖Fig.3 DModX control chart of 15 batches of JLD

圖4 15 批JLD PLS-DA 的得分Fig.4 PLS-DA score plot of 15 batches of JLD

圖5 JLD 中11 種成分的VIP 值Fig.5 VIP value of 11 components of JLD

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確定

本研究在《中國(guó)藥典》對(duì)JLD 各藥味明確規(guī)定的甘草苷、甘草酸、毛蕊花糖苷、橙皮苷、阿魏酸、6-姜辣素等6 個(gè)定量指標(biāo)的基礎(chǔ)上增加了與該方藥效相關(guān)的腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、蕓香柚皮苷、藁本內(nèi)酯5 個(gè)關(guān)鍵成分的定量控制。地黃為本方君藥，其中毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛等活性成分具有免疫調(diào)節(jié)、肝臟保護(hù)以及神經(jīng)保護(hù)等作用[10]。陳皮的主要活性成分是橙皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷，具有較好的抗氧化能力、抗炎、促胃動(dòng)力作用、抗腫瘤活性[11-14]。當(dāng)歸中阿魏酸、藁本內(nèi)酯等活性成分具有抗炎止痛、抗血小板凝聚等活性[15]；甘草中的甘草酸、甘草黃酮為生物活性較強(qiáng)的物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明甘草酸具有較強(qiáng)的保肝活性和腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可增強(qiáng)內(nèi)耳聽覺，能夠抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、解毒止咳、抗腫瘤等作用。甘草中的甘草苷具有抗?jié)?、抗菌、抗炎、解痙、鎮(zhèn)痛等作用[16-20]。尿苷、鳥苷、腺苷等核苷類成分能夠干擾病毒核酸的合成，通常為中成藥抗病毒的活性成分[21]。綜合藥理作用與色譜分離效果，最終確定該11個(gè)成分為指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件的選擇

中藥復(fù)方化學(xué)成分較為復(fù)雜，選擇梯度洗脫能更有利于成分整體信息的獲得。考察供試品溶液制備時(shí)不同提取溶劑（甲醇、乙醇及水）、不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、100%）甲醇和水的配比、不同提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取溶劑體積（10、15、20、25 mL）對(duì)JLD 中有效成分的影響，綜合考慮各待測(cè)成分的色譜峰峰形及分離度，最終選擇70%甲醇為JLD 干粉的提取溶劑。

考察了乙腈和甲醇作為有機(jī)相對(duì)提取效果的影響，結(jié)果甲醇作有機(jī)相基線漂移，峰形不對(duì)稱，因此選擇乙腈作有機(jī)相；為改善峰形，在水相中加入不同濃度的甲酸、乙酸和磷酸，結(jié)果表明加入0.1%磷酸時(shí)，分離效果好，基線平穩(wěn)；考察了梯度洗脫和等度洗脫，梯度洗脫時(shí)各物質(zhì)分離度高。

根據(jù)對(duì)照品預(yù)試驗(yàn)初步考察，腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯的最佳吸收波長(zhǎng)分別為260、256、285、322、276、330、283、283、252、280、281 nm，由于本研究測(cè)定成分較多，成分間波長(zhǎng)差異較大，為實(shí)現(xiàn)多成分含量同時(shí)測(cè)定，在綜合考察峰形、基線、吸收差異等多項(xiàng)干擾因素下，最終確定最佳的波長(zhǎng)切換法對(duì)多成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.3 結(jié)果分析

本研究在UPLC 多成分含量測(cè)定基礎(chǔ)上，結(jié)合PCA、PLS-DA 等相關(guān)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同批次JLD 物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量的批間差異性進(jìn)行了深入的分析，并在PCA 模型基礎(chǔ)上設(shè)定了Hotelling’sT2和DModX 控制限，實(shí)現(xiàn)對(duì)批次物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。該15 批物質(zhì)基準(zhǔn)均為正常批次樣品，其有效成分含量變化都沒有明顯的差異，但通過PCA 后可以看出，15 批樣品所用原藥材產(chǎn)地的差異在多指標(biāo)成分的含量上予以體現(xiàn)；進(jìn)一步通過PLS-DA中的VIP值可以判斷出，蕓香柚皮苷（源于陳皮）、甘草酸銨（源于甘草）、藁本內(nèi)酯（源于當(dāng)歸）和阿魏酸（源于當(dāng)歸、陳皮）是造成這些差異存在的主要原因，提示對(duì)這4 個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，有利于有效反映JLD 物質(zhì)基準(zhǔn)及其復(fù)方制劑的質(zhì)量變化屬性。

最后，本研究以JLD 中腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、阿魏酸、甘草苷、毛蕊花糖苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素、藁本內(nèi)酯等11 種主要成分為研究對(duì)象，首次建立了UPLC 同時(shí)測(cè)定JLD 中11 種成分的方法，同時(shí)對(duì)其提取條件、色譜條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并通過對(duì)15 批不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了影響JLD 物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量較大的4 種成分。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的方法滿足定量要求，且簡(jiǎn)單易行，為JLD 的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了方法基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)的制劑、藥效學(xué)研究提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突