殼聚糖交聯(lián)介孔二氧化硅固定化β-葡萄糖苷酶生物轉(zhuǎn)化淫羊藿苷研究

劉聰燕，李瑞云，馬程遙，劉玉萍，瞿 鼎，李曉琦，陳 彥*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，中藥組分與微生態(tài)研究中心，江蘇 南京 210028

寶藿苷I 是來源于小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Epimedium brevicirnuMaxim.的一種稀有次級黃酮苷，具有顯著的抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等藥理活性[1-2]，但原植物中寶藿苷I 的含量非常低，只有0.01%～0.25%，而市售高純度寶藿苷I 的價格約為每克7000元人民幣[3]。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的一種原型苷，價廉易得，由于其具有與寶藿苷I 相同的8-異戊烯基黃酮骨架，通過體外酶生物轉(zhuǎn)化的方法脫去其C-7 位葡萄糖基，即可制備藥理活性更強(qiáng)的寶藿苷I，故其可作為獲取寶藿苷I 的原料藥[4-5]。

β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷水解酶（EC 3.2.1.21，β-glucosidase，β-Glc），是一種廣泛存在于植物、動物和微生物中的纖維素水解酶。研究表明，在溫和的條件下，β-Glc 可定向水解淫羊藿苷為寶藿苷I，但存在價格昂貴、壽命短、易于變性或降解、難以回收和再利用等缺陷。采用吸附、包埋、交聯(lián)、共價結(jié)合等方法將酶固定在適宜載體材料上，可有效延長酶的使用壽命，提高其重復(fù)利用性能，降低生產(chǎn)成本[6-8]。SBA-15 型介孔二氧化硅（SBA-15）具有高度有序的2D 六邊形通道結(jié)構(gòu)、較寬的孔徑分布（5～30 nm）和良好的機(jī)械化學(xué)性能，是酶固定化的理想載體[9-10]。本研究采用吸附-交聯(lián)法制備殼聚糖（chitosan，CS）交聯(lián)SBA-15 固定化β-Glc（SBA-Glc-CS），通過對其理化性質(zhì)、酶泄露行為、最適酶解條件、酶解動力學(xué)和重復(fù)利用性進(jìn)行考察，證明了SBA-Glc-CS 促進(jìn)淫羊藿苷高效轉(zhuǎn)化為寶藿苷I 的潛力，從而為寶藿苷I 的綠色工業(yè)化生產(chǎn)提供新的思路和技術(shù)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity ARC 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；MS205DU 十萬分之一天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；THZ-82AHS 氣浴恒溫恒速振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；JEM-2100 型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL 公司；Tescan MAIA3 LM 超高分辨場發(fā)射掃描電鏡（SEM），捷克Tescan 公司；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀（FTIR）、1510 Multiskan GO 酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；TRISTAR3020 比表面積與孔隙度分析儀，美國Mike 公司。

1.2 材料

β-Glc，酶活≥6 U/mg，美國Sigma 公司；SBA-15，江蘇先豐納米材料科技有限公司；殼聚糖，脫乙酰度≥95%，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；25%戊二醛水溶液，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淫羊藿苷、寶藿苷I 對照品，批號分別為20110206、20120222，HPLC 測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，供含量測定用，購于上海源葉生物科技有限公司；BCA 試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析測定方法的建立[11-12]

2.1.1 酶活力測定方法 以淫羊藿苷為底物，在50 ℃、pH 6.0 條件下與適量酶振蕩反應(yīng)1 h 后，加入9 倍量甲醇終止反應(yīng)，渦旋離心后，取上清液進(jìn)行HPLC 檢測，計(jì)算酶活力、相對酶活力、酶活回收率和淫羊藿苷轉(zhuǎn)化率。

酶活力可定義為在50 ℃、pH 6.0 條件下，1 g酶每小時水解消耗淫羊藿苷的物質(zhì)的量，表示為μmol/(h·g)。

相對酶活力＝酶活力/最高酶活力，最高酶活力為同組實(shí)驗(yàn)中活力最高點(diǎn)的值，計(jì)為100%

酶活回收率＝固定化酶總活力/被固定的游離酶總活力

轉(zhuǎn)化率＝(反應(yīng)初始淫羊藿苷量－反應(yīng)終止淫羊藿苷量)/反應(yīng)初始淫羊藿苷量

色譜條件：依利特Supersil ODS2 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液：0～7 min，70%甲醇；7～8 min，70%～80%甲醇；8～20 min，80%甲醇；檢測波長270 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。HPLC 色譜圖見圖1。

2.1.2 載酶量測定方法 采用二辛可寧酸（BCA）法，以牛血清蛋白（BSA）質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度（A）值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝0.007 9X＋0.009 6，R2＝0.998 9，結(jié)果表明BSA 在2.8～166.7 μg/mL 與A值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 混合對照品 (A) 和酶水解樣品 (B) 溶液的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of mixed standard solution (A) and sample solution after enzymatic hydrolysis (B)

將待測樣品溶液的A值代入回歸方程，計(jì)算固定化酶的載酶量和固定率。

載酶量＝被固定的酶量/固定化酶的量

固定率＝被固定的酶量/固定化過程中投入的總酶量

2.2 SBA-Glc-CS 的制備工藝優(yōu)化

2.2.1 固定化β-Glc 的制備 取適量SBA-15 超聲分散在2 mL 具有一定pH 值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，加入適量β-Glc 后，室溫下200 r/min 震蕩孵育一定時間，再分別加入0.2 mL 殼聚糖溶液（5 mg/mL，0.5%稀鹽酸溶液溶解）和0.2 mL 1.0%戊二醛溶液，室溫下磁力攪拌1 h，離心收集沉淀，37 ℃真空干燥過夜，即得殼聚糖交聯(lián)SBA-15 固定化β-Glc（SBA-Glc-CS）。固定化過程見圖2。

圖2 SBA-Glc-CS 的制備過程示意圖Fig.2 Principle scheme of perparation of SBA-Glc-CS

2.2.2 固定化參數(shù)優(yōu)選 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備固定化β-Glc，分別考察不同固定化pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、固定化時間（0.5、1、2、3、6、8、12 h）和酶質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5、6、7、8、9 mg/mL）對固定化酶酶活力和載酶量的影響，結(jié)果分別見表1～3。當(dāng)固定化pH 值為6.0、固定化時間為8 h、酶質(zhì)量濃度為7 mg/mL 時，SBA-Glc-CS 的酶活力最高，在該條件下制備的固定化酶的酶活力為439.2 μmol/(h·g)，酶活回收率為93.7%，載酶量為1.120 g/g 載體，固定率為92.8%，結(jié)果表明殼聚糖交聯(lián)SBA-15 不但可高效固定β-葡萄糖苷酶，還能較好地保持其酶活力。

表1 固定化pH 值對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響( = 3)Table 1 Effect of immobilization pH values on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS (= 3)

表1 固定化pH 值對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響( = 3)Table 1 Effect of immobilization pH values on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS (= 3)

pH 值 相對酶活力/% 載酶量/(mg·g-1)3.0 22.1±3.2 945.7±25.2 4.0 69.2±4.3 945.4±34.7 5.0 87.3±2.6 954.1±34.5 6.0 100.0±1.9 947.5±27.4 7.0 66.0±3.9 878.4±24.3 8.0 63.4±2.5 853.5±25.8

表2 固定化時間對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響( = 3)Table 2 Effect of immobilization time on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS ( = 3)

表2 固定化時間對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響( = 3)Table 2 Effect of immobilization time on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS ( = 3)

時間/h 相對酶活力/% 載酶量/(mg·g-1)0.5 86.2±2.5 931.9±25.3 1.0 80.6±4.0 973.0±34.8 2.0 69.8±2.1 924.7±26.4 3.0 66.7±3.4 962.8±24.1 6.0 62.9±2.5 970.5±20.9 8.0 100.0±3.6 951.7±34.3 12.0 32.4±2.9 935.1±26.6

2.3 SBA-Glc-CS 的質(zhì)量評價

2.3.1 SEM 和TEM 觀察 取適量干燥樣品粉末，置于SEM 下觀察并拍照；取適量樣品粉末，用無水乙醇超聲分散后，滴于銅網(wǎng)上，于室溫干燥后，立即置于TEM 下觀察并拍照；結(jié)果見圖3。SBA-15和SBA-Glc-CS 的SEM 圖均呈典型的具有一定長度的蠕蟲狀結(jié)構(gòu)，TEM 圖顯示2 個樣品均存在均一有序的長通道介孔結(jié)構(gòu)，SBA-Glc-CS 的表面呈現(xiàn)一些不透明的陰影，可能與殼聚糖交聯(lián)有關(guān)。

表3 固定化酶質(zhì)量濃度對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響 ( = 3)Table 3 Effect of immobilization enzyme concentration on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS (n = 3)

表3 固定化酶質(zhì)量濃度對SBA-Glc-CS 酶活力和載酶量的影響 ( = 3)Table 3 Effect of immobilization enzyme concentration on enzyme activity and loading capacity of SBA-Glc-CS (n = 3)

酶質(zhì)量濃度/(mg·mL-1) 相對酶活力/% 載酶量/(mg·g-1)1.0 39.6±3.2 194.5±7.7 2.0 28.6±2.1 392.6±18.5 3.0 69.4±2.3 564.1±26.3 4.0 63.6±3.1 763.2±25.8 5.0 64.2±2.2 947.5±28.7 6.0 81.0±4.4 1 046.3±32.9 7.0 100.0±2.7 1 120.5±30.4 8.0 74.1±2.5 1 314.1±48.6 9.0 74.3±3.6 1 417.3±42.5

圖3 SBA-15和SBA-Glc-CS的SEM (A,C) 和TEM (B,D)表征圖Fig.3 Representative SEM (A,C) and TEM (B,D) images of SBA-15 and SBA-Glc-CS

圖4 SBA-15、β-Glc 和SBA-Glc-CS FTIR 表征圖Fig.4 FTIR spectrum of SBA-15,β-glucosidase and SBAGlc-CS

2.3.2 FTIR 分析 取適量樣品與KBr 按一定比例混合均勻，經(jīng)壓片機(jī)壓制成透明薄片后，在傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行測試，結(jié)果見圖4。SBA-15 和SBA-Glc-CS 均在462、800、1100 cm-1處呈現(xiàn)SiO2的特征吸收峰，分別歸屬于Si-O-Si 的彎曲振動、對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動；β-Glc 在1653、1545、1260 cm-1處存在3 個特征吸收峰，分別歸屬于酶蛋白的酰胺I 帶（C＝O 伸縮振動）、酰胺II 帶（N-H 伸縮振動，C-N 彎曲振動）和酰胺III 帶（N-H彎曲振動，C-N 伸縮振動）。SBA-Glc-CS 在1653、1409 cm-1處存在的特征吸收峰可分別歸屬于β-Glc分子的酰胺I 帶（C＝O 伸縮振動）和氨基酸側(cè)鏈上-CH3中C-H 對稱伸縮振動，表明β-Glc 被成功固定；此外，SBA-Glc-CS 在1640 cm-1處存在1 個振動強(qiáng)度較弱的特征吸收峰，可歸屬于殼聚糖交聯(lián)過程中戊二醛的醛基與殼聚糖、酶分子中氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)時生成的C＝N 雙鍵的伸縮振動，表明殼聚糖交聯(lián)成功。

2.3.3 N2吸附-脫附分析 取適量樣品經(jīng)100 ℃脫氣處理過夜后，于液氮（-196 ℃）下測定其N2吸附-脫附等溫線，結(jié)果見圖5。SBA-15 和SBA-Glc-CS的吸脫附曲線均呈典型的IV 型曲線，且均具有H1滯留環(huán)，表明2 種樣品均存在均勻分布的介孔，酶的固定化過程不會改變SBA-15 的介孔骨架結(jié)構(gòu)。采用BET 法計(jì)算SBA-15 和SBA-Glc-CS 的比表面積分別為468.4、313.1 m2/g，采用BJH 法計(jì)算SBA-15 的孔容、孔徑分別為1.22 cm3/g 和8.8 nm，SBA-Glc-CS 的孔容、孔徑分別為0.74 cm3/g 和8.2 nm，SBA-Glc-CS 的比表面積、孔容、孔徑均較SBA-15 顯著降低，表明酶被成功地固定在SBA-15的介孔中。

圖5 SBA-15 (A) 和SBA-Glc-CS (B) 的N2 吸附-脫附等溫線和孔徑分布圖Fig.5 N2 adsorption-desorption isotherms and pore size distributions of SBA-15 (A) and SBA-Glc-CS (B)

2.3.4 酶泄露評價 分別稱取適量SBA-Glc和SBAGlc-CS，均勻分散在pH 5.0 的磷酸鹽緩沖溶液中，置于恒溫氣浴振蕩器中（50 ℃，200 r/min）孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3、6、9、12、24 h，于各個時間點(diǎn)分別取樣200 μL，同時補(bǔ)加200 μL 緩沖液，取出的樣品經(jīng)離心后取上清液測定泄漏的β-Glc 含量，結(jié)果見圖6。未進(jìn)行殼聚糖交聯(lián)的SBA-Glc 隨著孵育時間的延長，存在明顯的酶泄漏現(xiàn)象，其24 h 的累計(jì)泄漏率高達(dá)18.7%，而經(jīng)殼聚糖交聯(lián)后的SBA-Glc-CS 的24 h 累計(jì)泄漏率僅為1.4%，表明殼聚糖交聯(lián)可有效改善固定化酶的酶泄漏現(xiàn)象。

2.4 固定化β-Glc 酶解淫羊藿苷的最適條件考察

按“2.1.1”項(xiàng)下方法測定不同pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、溫度（25、37、50、60 ℃），底物質(zhì)量濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL）條件下固定化和游離β-Glc 的酶活力，計(jì)算相對酶活；以淫羊藿苷轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，考察固定化和游離β-Glc 的最適酶解時間（0.5、1、2、4、6、8、10、12 h），結(jié)果見表4～7。固定化和游離β-Glc 的最適pH 值均為6.0，最適溫度游離酶為60 ℃，固定化酶為50 ℃，最適底物質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，游離β-Glc 和固定化β-Glc 的最適酶解時間分別為4 h和8 h，淫羊藿苷的轉(zhuǎn)化率均在95%以上，且酶解產(chǎn)物均為寶藿苷I。

圖6 固定化β-Glc 的累計(jì)泄漏率 ( = 3）Fig.6 Cumulative leakage rate of immobilized β-glucosidase ( = 3)

表4 游離與固定化β-Glc 的最適酶解pH 值考察 (n = 3)Table 4 Optimal pH of free and immobilized β-glucosidase( = 3)

表4 游離與固定化β-Glc 的最適酶解pH 值考察 (n = 3)Table 4 Optimal pH of free and immobilized β-glucosidase( = 3)

pH 值 相對酶活力/%游離酶 固定化酶4.0 20.6±3.5 38.8±4.8 5.0 93.1±2.6 62.6±3.7 6.0 100.0±2.7 100.0±3.2 7.0 54.8±4.3 93.3±5.4 8.0 7.3±3.6 64.7±3.1

表5 游離與固定化β-Glc 的最適酶解溫度考察 (n = 3)Table 5 Optimal temperature of free and immobilized β-glucosidase ( = 3)

表5 游離與固定化β-Glc 的最適酶解溫度考察 (n = 3)Table 5 Optimal temperature of free and immobilized β-glucosidase ( = 3)

溫度/℃ 相對酶活力/%游離酶 固定化酶25 13.9±3.6 75.6±3.4 37 28.4±4.9 78.3±3.7 50 80.9±3.3 100.0±4.6 60 100.0±3.7 63.1±2.9

2.5 固定化β-Glc 的酶學(xué)性能考察

2.5.1 酶解動力學(xué)參數(shù) 按“2.2.1”項(xiàng)下酶活測定方法，分別稱取適量游離和固定化β-Glc，水解不同質(zhì)量濃度（1.0、1.25、1.50、1.75、2.0 mg/mL）淫羊藿苷，測定并計(jì)算在酶促反應(yīng)初始階段（淫羊藿苷轉(zhuǎn)化量＜5%）單位時間內(nèi)淫羊藿苷的消耗量，既得酶解反應(yīng)的初速度（V）。根據(jù)求導(dǎo)后的米氏方程1/V＝Km/(Vmax[S])＋1/Vmax（Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度，Vmax為最大反應(yīng)速率）計(jì)算Km和Vmax。結(jié)果見表8，2 種酶的1/V均和1/[S]呈良好的線性擬合關(guān)系，與游離酶相比，固定化β-Glc 的Km值變大，Vmax值變小，表明β-Glc 經(jīng)固定后對淫羊藿苷的親和力有所下降。

表6 游離與固定化 β-Glc 的最適底物質(zhì)量濃度考察(= 3)Table 6 Optimal substrate concentration of free and immobilized β-glucosidase ( = 3)

底物濃度/(mg·mL-1)相對酶活力/%游離酶 固定化酶0.25 59.8±4.1 80.6±3.6 0.50 100.0±3.7 100.0±3.2 0.75 83.7±3.6 84.3±2.1 1.00 70.2±3.6 60.8±4.6 1.50 76.4±4.3 45.6±4.8

表7 游離與固定化β-Glc 的最適酶解時間考察 (n = 3)Table 7 Optimal hydrolysis time of free and immobilized β-glucosidase ( = 3)

表7 游離與固定化β-Glc 的最適酶解時間考察 (n = 3)Table 7 Optimal hydrolysis time of free and immobilized β-glucosidase ( = 3)

時間/h 淫羊藿苷轉(zhuǎn)化率/%游離酶 固定化酶0.5 75.5±3.3 9.8±4.9 1.0 88.1±2.8 21.1±5.6 2.0 92.3±3.7 42.8±4.5 4.0 96.5±4.6 70.3±5.1 6.0 95.8±3.0 88.6±4.3 8.0 97.4±3.5 95.5±4.6 10.0 97.8±3.2 98.6±2.9 12.0 98.1±2.7 99.1±2.0

2.5.2 重復(fù)利用性考察 取適量固定化β-Glc 與淫羊藿苷按“2.4”項(xiàng)下最適酶解條件反應(yīng)后，離心，洗滌，收集沉淀物加入淫羊藿苷繼續(xù)反應(yīng)，重復(fù)上述操作5 次，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測定酶活力，結(jié)果5 次實(shí)驗(yàn)的相對酶活力分別為（100.0±2.1）%、（89.2±4.5）%、（84.0±3.2）%、（82.9±3.1）%、（81.0±2.7）%（n＝3），固定化β-Glc 在重復(fù)利用5次后的殘余相對酶活力仍保持在80%以上，而游離酶只能利用1 次，結(jié)果表明經(jīng)交聯(lián)SBA-15 固定化可顯著提高β-Glc 的利用效率，促進(jìn)淫羊藿苷的高效生物轉(zhuǎn)化。

表8 游離和固定化β-Glc 的酶解動力學(xué)參數(shù)Table 8 Enzymatic kinetic parameters of free and immobilized β-glucosidase

3 討論

物理吸附是一種簡單、溫和、經(jīng)濟(jì)的酶固定化方法，酶分子通過氫鍵、范德華力、靜電等作用被載體固定化，由于作用力較弱且不影響酶的活性位點(diǎn)，從而保持了固定化酶較高的酶活回收率，但也存在酶易泄漏、穩(wěn)定性較差等問題[13-14]。吸附-交聯(lián)法是目前最常用的一種復(fù)合固定化方式，該方法可以使酶在較為溫和的條件下被固定化，既能較好地保持酶活力，又能防止酶泄漏[15-16]。

SBA-15 是一種具有二維立方體棒狀結(jié)構(gòu)的介孔硅，其特殊的長通道介孔為酶的吸附固定提供了較大的空間。研究表明，介孔二氧化硅的孔徑與酶的裝載量、酶活力、穩(wěn)定性密切相關(guān)，若孔徑顯著小于待固定酶的分子尺寸，則酶大部分都不能進(jìn)入孔道內(nèi)，造成載酶量偏低；若孔徑顯著大于待固定酶的分子尺寸，則通過吸附作用固定的酶很容易從孔道中泄漏，造成酶活力下降和穩(wěn)定性變差，因此根據(jù)不同酶的分子尺寸選擇適宜孔徑的介孔硅至關(guān)重要[17-18]。此外，固定化溶液pH 值、吸附時間、酶濃度等因素也會顯著影響固定化酶的載酶量和酶活力，但載酶量越高，酶活力卻不一定越高，這可能是由于過多的酶分子擁堵在介孔二氧化硅的孔道里，反而阻礙了底物分子與酶的充分接觸反應(yīng)[9]。

本研究選用的SBA-15 經(jīng)N2吸附-脫附分析測定其孔徑為8.8 nm，稍大于β-Glc 的分子尺寸（相對分子質(zhì)量130 000，6.7 nm）[19]，在最優(yōu)條件下制備的固定化β-Glc 的載酶量高達(dá)1.120 g/g 載體，酶活力高達(dá)439.2 μmol/(h·g)，表明SBA-15 是固定β-Glc 的理想載體。為了改善酶的泄漏，本研究以廣泛應(yīng)用的天然殼聚糖為介孔封堵劑，發(fā)現(xiàn)適量的殼聚糖交聯(lián)可顯著降低固定化β-Glc 的酶泄漏量，同時還能較好地保持其酶活力[20-21]；在交聯(lián)過程中，殼聚糖的用量需要控制，交聯(lián)量過低則無法改善酶泄漏，交聯(lián)量過高則會堵住介孔，不利于底物分子進(jìn)入孔道與酶發(fā)生反應(yīng)。與游離酶相比，經(jīng)殼聚糖交聯(lián)SBA-15 固定化的β-Glc 酶解淫羊藿苷的最適反應(yīng)pH 值、底物濃度保持不變，最適溫度有所降低，酶解等量淫羊藿苷所需時間變長，這可能是由于固定化過程在一定程度上影響了酶的活性中心，降低了酶與底物的親和力（Km變大），繼而導(dǎo)致酶解速率變慢（Vmax變?。?，酶解時間延長。但固定化β-Glc 具有制備工藝簡單、載酶量高、易于分離、穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用等優(yōu)勢，在循環(huán)利用5 次后的剩余酶活依然保持在80%以上，總體酶解效率較游離酶（只能利用1 次）顯著提高，促進(jìn)了淫羊藿苷在體外高效轉(zhuǎn)化為寶藿苷I，該研究為獲取活性更強(qiáng)的中藥稀有次級苷或苷元提供了新的技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突