抗寒桑樹種質(zhì)1-脫氧野尻霉素含量測定與分析

賈漫麗，李娜，李季生，范偉，王彬彬，楊曉東

(1 河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 承德 067000；2 承德醫(yī)學(xué)院 蠶業(yè)研究所，河北 承德 067000)

中醫(yī)藥書籍中記載桑葉味苦、甘，可以疏風(fēng)清熱、清肝明目并治療消渴癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑樹含有的藥用成分很多，以1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)為代表的生物堿是其中最重要的一種[1]。DNJ在動物體內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的α-糖苷酶抑制劑的特性[2]，能有效抑制餐后血糖水平的升高，對預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病[3]、高血壓、高血脂癥[4]等顯示出良好的生物活性[5-6]。DNJ以桑樹中含量最高(0.1%～0.6%)，是桑樹區(qū)別其他藥用植物最具有特色和代表性的次生代謝產(chǎn)物，也是研制新型降糖類藥物的關(guān)鍵資源。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在桑樹DNJ的提取測定[7-8]、來源合成[9]、分布規(guī)律[10]、作用機理[11]等方面開展了大量的研究，為桑樹DNJ的研究奠定了基礎(chǔ)。李有貴等[12]報道了云南省來源不同的59份野生桑桑葉中的DNJ含量差異顯著，最高含量達到0.791 1%，最低僅為0.004 6%。劉凡等[13]測定了廣州國家桑樹種質(zhì)資源圃的98份桑樹品種資源桑葉DNJ含量，結(jié)果顯示品種間差異明顯。張魏琬麒等[14]研究了桑葉中的DNJ含量隨季節(jié)產(chǎn)生的動態(tài)變化規(guī)律，得出結(jié)論DNJ在7-8月份氣溫較高時含量最高。金超等[15]對華東蠶區(qū)5個栽培桑品種不同葉位DNJ含量進行測定，結(jié)果呈現(xiàn)上位葉>中位葉>下位葉的變化趨勢。目前，對于河北地區(qū)保存豐富的桑樹品種資源尚缺乏系統(tǒng)的調(diào)查研究和檢測分析?；诖诉\用高效液相色潽法對承德地區(qū)保存的57份典型桑樹種質(zhì)資源的新梢進行DNJ含量測定，并進行評價分析，以篩選出適合北方地區(qū)生長的DNJ高含量的桑樹品種(系)，為藥用、食用桑樹品種的選育提供依據(jù)，同時也為降血糖藥物的開發(fā)提供優(yōu)良的資源。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

1.1.1 桑葉樣品 供試桑葉樣品于2018年6月底采自河北省承德市承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所種質(zhì)資源圃，57份桑樹種質(zhì)資源，每個桑樹品種均采摘其新梢。將新鮮桑葉樣品在-20 ℃冰箱預(yù)凍，再進行真空冷凍干燥，1段溫度-40 ℃凍4 h，2段開始抽真空，每小時上升5 ℃逐漸升至35 ℃恒溫。將干燥后的桑葉粉碎并過60目篩，裝入密封的樣品瓶-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 1-脫氧野尻霉素(DNJ)標準品(純度≥98%)、9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)、色譜純甲醇、色譜純乙腈等均購自上海阿拉丁試劑，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 島津LC-2030高效液相色譜系統(tǒng)，配有SPD-20AV紫外檢測器；OHAUS AR224CN分析天平(奧豪斯儀器有限公司)，OHAUS鹵素水分測定儀，KS-300EⅡ型超聲波清洗機(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)，VELOCITY 18R臺式冷凍高速離心機(Dynamica)；Micro Pure UV/UF超純水系統(tǒng)(Thermo)。

1.2 樣品中DNJ的提取及含量測定

樣品提?。壕_稱取待測樣品250 mg，加入0.05 mol/L的HCl 25 mL，漩渦混勻2 min，超聲波提取30 min，然后12 000 r/min離心30 min，收集上清液。沉淀物重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.05 mol/L HCl定容至50 mL，即得到待測樣品提取液[16]。

衍生化處理：取待測樣品提取液200 μL于1.5 mL離心管，加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)338 μL，再加入濃度5 mmol/L的衍生化試劑FMOC-Cl(乙腈250 μL，超純水250 μL)，充分混勻，20 ℃下水浴20 min。加入1 mol/L甘氨酸(Gly)200 μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，加入1%(V/V)醋酸溶液132 μL，以生成穩(wěn)定的DNJ-FMOC。混勻后用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液備用[16-17]。

色譜條件：采用RP-HPLC紫外檢測法測定，色譜柱為Kromasail-C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)及ODS3預(yù)柱(5 μm，4.6 mm×10 mm)，檢測波長254 nm。室溫25 ℃，柱溫25 ℃，流動相為乙腈-0.1%醋酸混合相(55∶45，V/V)，流速為1.0 mL/min，進樣體積20 μL，停止時間60 min。分析軟件為Lab solutions色譜處理工作站，用外標法計算樣品提取液中DNJ的含量。每個待測樣本重復(fù)測定3次。桑葉中DNJ質(zhì)量比(mg/g)=提取液DNJ濃度(μg/mL)×提取液體積(mL)/樣品質(zhì)量(g)/1 000。

1.3 標準曲線的制備和線性范圍考察

配制濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的DNJ標準品溶液，各取200 μL按上述1.2的方法進行衍生化后，測定峰面積。以DNJ標準品溶液濃度X對色譜峰面積Y進行線性回歸。標準品溶液在1～60 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與實際數(shù)據(jù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=11 283X-4 874.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉檢出DNJ的高效液相色譜圖譜

DNJ的高效液相色譜圖見圖1。

如圖1(A-C)所示，試劑中的水解副產(chǎn)物 FMOC-OH 和 Gly-FMOC 色譜峰與測定的 DNJ-FMOC色譜峰能良好分離，不干擾測定目標成分的準確性。高效液相色譜顯示DNJ標準品和樣品中 DNJ-FMOC的保留時間為 5.838 min，與其他組分之間呈現(xiàn)良好的基線分離。

圖1 桑樹新梢樣品中DNJ的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC of DNJ in Mulberry leaf tip samples

2.2 57份桑樹種質(zhì)資源新梢中DNJ含量比較

57份桑樹種質(zhì)資源DNJ含量檢測結(jié)果見表1。

表1 57份桑樹品種資源的桑樹新梢中DNJ含量比較Table 1 Comparison of DNJ content in new shoot of 57 mulberry cultivars

表1(續(xù))

表1(續(xù))

57份桑樹種質(zhì)資源DNJ含量分布區(qū)間見圖2。

圖2 57份桑樹種質(zhì)資源新梢中DNJ含量分布Figure 2 The distribution of DNJ content in the new shoots of 57 mulberry germplasm resources

57份桑樹種質(zhì)資源的DNJ含量差異較大，質(zhì)量比變幅為 1.288～5.183 mg/g。在供試品種中， DNJ含量最高的品種有2個，分別為遼寧的家桑(5.183 mg/g)，其次是河北的條墩桑(5.020 mg/g)；含量最低的是禾桑(1.288 mg/g)，最高含量與最低含量相差 4.02 倍。由圖 2 可知，DNJ 含量的分布區(qū)間相對集中，質(zhì)量比較高分布在 4.0～5.0 mg/g 之間有6 種，分別是山東牛筋，遼寧的寬甸 6號和鳳凰山 6號，其余3個黑皮、張家口 25號、遵化白椹均來自河北；質(zhì)量比分布在 2.0～3.0 mg/g 之間有21 種，占桑樹品種資源總數(shù)的36.84%；質(zhì)量比分布在 3.0～4.0 mg/g 之間有22 種，占桑樹品種資源總數(shù)的 38.60% ；質(zhì)量比較低的分布在1.0～2.0 mg/g 之間的有6個品種，分別為烏克蘭 1號、魯桑 6號、宜秋、勺桑、節(jié)曲、禾桑。

2.3 不同桑種及來源地區(qū)的種質(zhì)資源DNJ含量比較

不同桑種的桑樹種質(zhì)資源DNJ含量比較見表2。

表2 不同桑種樣品中DNJ含量比較Table 2 Comparison of DNJ content in different mulberry species

不同來源地區(qū)的桑樹種質(zhì)資源DNJ含量比較見圖 3。

圖3 不同來源地區(qū)的桑樹品種桑樹新梢中DNJ含量比較Figure 3 comparison of DNJ content in mulberry leaf tips of mulberry species from different sources

所檢測的57份桑樹品種資源中白桑和魯桑占比最多，白桑有23個品種，平均DNJ質(zhì)量比為3.374 mg/g，占桑樹品種資源總數(shù)的40.35%，DNJ 質(zhì)量比最高的 2個品種家桑、條墩桑均為白桑種。魯桑有29個品種，平均DNJ質(zhì)量比為 2.877 mg/g，占桑樹資源總數(shù)的50.88%，說明白桑、魯桑種在承德地區(qū)的適應(yīng)能力較強。華桑僅有1個品種為涿鹿6號，雞桑有2個品種分別為寬甸 6號和鳳凰神 6號，DNJ 質(zhì)量比均較高，都在 4 mg/g 以上。蒙桑品種僅有2個為蒙果桑和石門臺蒙桑，DNJ 質(zhì)量比分別為 2.276 mg/g ，3.303 mg/g。

由圖3可知，57份桑樹種質(zhì)資源來自全國 11個省、市及自治區(qū)，以及朝鮮、日本和前蘇聯(lián)。其中河北的地方品種(系)或者栽培品種較多，數(shù)量達到 25個，平均DNJ質(zhì)量比也較高，達到 3.212 mg/g。其次有6個品種引自山東，5個品種引自遼寧，分別有4個品種來自朝鮮和日本，極少數(shù)品種來自江浙及國內(nèi)其他地區(qū)。研究結(jié)果表明，來源地區(qū)不同的桑樹品種其DNJ含量差異較大，原產(chǎn)地河北的大部分品種DNJ含量均處于較高水平，其他地區(qū)則較低，這可能與本土品種的生態(tài)適應(yīng)性相關(guān)，南方品種耐寒性較差，引進后生長勢較弱，次生代謝產(chǎn)物積累的也相對較少有關(guān)。

3 討論

DNJ首先是從桑葉根皮中分離得到，除了?？浦参镆酝猓渌参镏幸泊嬖谥鳧NJ，但含量極低[18]。已有研究表明，桑樹品種、葉片部位、季節(jié)氣候、發(fā)育階段、處理方式[19-20]等均是影響DNJ含量的重要因素。其中，DNJ在桑葉中的分配量由大到小為春芽、嫩芽、嫩葉、成熟葉、老葉[10]。本研究運用高效液相色譜紫外檢測法對河北省保存的 57份桑樹種質(zhì)資源進行DNJ定量分析。試驗設(shè)計采樣部位為桑樹新梢，之所以選擇新梢部位，是因為當有機物進入植物體內(nèi)以后，向上傳輸?shù)秸谏L的枝葉頂端[21]，因此存在頂端優(yōu)勢，桑枝新梢葉中營養(yǎng)物質(zhì)充足，活性物質(zhì)含量也相應(yīng)較高。試驗結(jié)果顯示，不同桑樹品種新梢DNJ含量差異較大，原產(chǎn)河北、遼寧品種較多且DNJ含量較高。

DNJ 或許和其他次生代謝產(chǎn)物一樣，在植物進化過程中發(fā)揮著重要的防御作用[22]。目前，針對不同地區(qū)不同品種桑樹DNJ含量的測定和比較已有大量研究。李有貴、陳松[12，23]分別對云南省不同地域的野生、栽培桑樹品種DNJ含量進行差異檢測，結(jié)果顯示，開遠的巖桑DNJ含量最高，質(zhì)量分數(shù)達到 0.791 1%，是可見報道中DNJ含量最高的桑樹資源。丁俊男[24]研究發(fā)現(xiàn)，北方 8個桑樹品種中黑龍江地方品種泰來桑上位葉中DNJ含量達到 4.20 mg/g，高于其他桑樹品種。葉晶晶[10]用反相高效液相色譜法測定山東省有代表性的18個桑品種的摘芯芽中 1-DNJ 含量，沙 2×倫教 109 和秋雨最高，質(zhì)量分數(shù)均達 0.328 0%左右。劉凡[13]所測華南地區(qū)(廣州)的 98 份桑樹品種資源中，多數(shù)供試桑樹品種的桑葉DNJ含量分布在 0～1.00 mg/g 之間，其中育 7803 含量最高，質(zhì)量比為1.54 mg/g。金超[15]報道華東蠶區(qū) 5個栽培桑品種育 711號、 7307 、湖桑 32號、金 10、新一之瀨葉片中DNJ的質(zhì)量比在 1.89～3.06 mg/g之間。禚蘇[25]報道安康地區(qū) 24個桑樹品種中旬陽青皮荊桑中的 DNJ 含量最高，為 0.381 5%。

與已有研究結(jié)果相比，本試驗測定品種桑葉中DNJ含量相對較高，質(zhì)量比變幅在 1.288～5.183 mg/g之間，最高含量的品種只低于云南省開遠的野生品種巖桑。其中 2個品種達到 5.0 mg/g 以上， 6個品種在 4.0～5.0 mg/g 之間，75.0% 的品種 DNJ 質(zhì)量比分布在 2.0～4.0 mg/g。可能與桑樹長期以來生長的環(huán)境因素相關(guān)，氣候溫度作為環(huán)境脅迫因子，其變化可能會影響桑葉中次生代謝產(chǎn)物的合成表達與積累[24]。承德地區(qū)冬季寒冷，春秋氣溫偏低且晝夜溫差較大，霜害嚴重，因此種質(zhì)資源圃里的桑樹品種大部分為河北省地方品種(系)，極少部分引種的南方品種經(jīng)長期馴化也已經(jīng)與環(huán)境產(chǎn)生一定的適應(yīng)性[26]。有關(guān)DNJ在桑樹體內(nèi)的合成代謝機制，本課題組正在進一步研究。本試驗結(jié)果顯示，家桑、條墩桑、山東牛筋、黑皮、遵化白椹等品種DNJ含量較高，為選育高DNJ含量的桑樹的藥用、茶用及食品開發(fā)等提供了新的種質(zhì)資源信息。此外，除了對DNJ含量有所了解，還要依據(jù)不同用途，綜合考慮其他活性物質(zhì)，如黃酮類、多酚類，以及品種葉片生長量和抗病性等方面，選擇最佳品種應(yīng)用。