重組人生長激素對矮小癥患兒rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型及IGF-1的影響

謝坤霞,王翠翠,劉 慶(延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，延安 716000)

矮小癥是兒科常見疾病，指每年身高生長長度小于5 cm，且身高比同性別、同年齡及同種族兒童低2個標(biāo)準(zhǔn)差的兒童。該病發(fā)病率高，在中小學(xué)人群中的發(fā)病率高達(dá)3%，但治愈率不足1%，存在患病率高、診斷及治療率低的現(xiàn)象[1]。矮小癥發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，包括生長激素缺乏或分泌不足、體質(zhì)性青年發(fā)育期延遲、宮內(nèi)生長遲緩、骨骼發(fā)育障礙等，其中由生長激素缺乏所致的矮小癥稱生長激素缺乏性矮小癥(GHD)[2]。GHD的發(fā)生與諸多基因有關(guān)，近年來隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，大量研究證實，遺傳學(xué)改變在該病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在成骨不全、骨質(zhì)疏松等相關(guān)骨病進(jìn)展中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，7號染色體上人類同源物(BBF2H7)基因與軟骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)知網(wǎng)應(yīng)激存在緊密聯(lián)系。胰島素樣增長因子-1(IGF-1)是一種活性蛋白多肽物質(zhì)，對嬰兒生長具有重要意義[4]。重組人生長激素(rhGH)是應(yīng)用廣泛的治療矮小癥藥物，有助于促進(jìn)患兒生長發(fā)育，獲得滿意的身高增長，但目前有關(guān)該藥物對GHD患兒BBF2H7基因不同基因型影響的研究報道較少。本研究以126例GHD患兒為研究對象，探究rhGH對患兒BBF2H7基因rs66593747位點(diǎn)不同基因型及IGF-1水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，選取收治的126例GHD患兒作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，身高比同年齡、同性別、同種族正常兒童低2個標(biāo)準(zhǔn)差，3歲至青春期年生長長度<5 cm，青春期年生長長度<6 cm；②胰島素峰值<10 ng·mL-1；③血常規(guī)、血脂檢查結(jié)果正常；④甲狀腺功能未見異常，無智力障礙；⑤監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并慢性疾病、骨骼發(fā)育障礙、遺傳代謝疾病者；②合并其他內(nèi)分泌激素異常疾病者；③排除垂體腫瘤等占位性疾病及特發(fā)性矮小癥患兒；④近3個月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、外源性維生素D等患兒。將126例GHD患兒設(shè)為觀察組，另外選取同期健康體檢兒童100例設(shè)為對照組。觀察組男82例，女44例，平均年齡為(10.18±1.92) 歲；對照組男64例，女36例，平均年齡為(10.03±1.61) 歲。2組患兒基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方法 觀察組患兒接受重組人生長激素(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號S20050024)治療，于睡前30 min在腹部臍周皮下注射，起始劑量為0.1 IU·kg-1，每日1次，并根據(jù)體質(zhì)量及IGF-1水平調(diào)整劑量，持續(xù)治療3個月。

1.2.2IGF-1檢測方法 抽取所有患兒空腹靜脈血4 mL，以2 500 r·min-1離心5 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用IMMULITE1000型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(SIEMENS公司)測定血清中IGF-1水平，試劑盒由美國德普公司提供，檢測步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.3rs66593747基因位點(diǎn)不同基因分型 提取全基因組DNA，并對其進(jìn)行濃度和純度檢測，使其達(dá)到單核苷酸多態(tài)性等位基因分型的試驗標(biāo)準(zhǔn)，純度(A260/A280)在1.7～1.9之間，質(zhì)量濃度>20 ng·μL-1，提取完后將DNA樣本分裝至1.5 mL LEP管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?；取DNA提取樣本，采用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物和Taqman-MGB探針購自上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3觀察指標(biāo) ①比較CHD患兒和對照組兒童年齡、性別、體質(zhì)量、身高、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、生長長度和IGF-1水平等資料；②比較CHD患兒治療前后身高相關(guān)指標(biāo)變化情況，包括身高、體質(zhì)量、BMI、生長長度及IGF-1；③分析治療前后GHD患兒血清IGF-1水平變化情況；④比較GHD患兒rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型臨床基線資料及rhGH治療期間月身高增長情況；④分析rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型與rhGH療效的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對本研究進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料(年齡、身高和體質(zhì)量等)組內(nèi)用配對樣本t檢驗，組間用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間計量資料間的比較采用單因素方差分析，性別等計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組一般臨床資料比較 治療前，觀察組身高、體質(zhì)量及IGF-1水平顯著小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，2組年齡、性別和BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組一般臨床資料比較

2.2GHD患兒治療前后的相關(guān)指標(biāo)變化 治療后，GHD患兒身高、體質(zhì)量、生長長度及IGF-1水平顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，BMI治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 GHD患兒治療前后的相關(guān)指標(biāo)變化

2.3治療前后GHD患兒的血清IGF-1水平變化情況 治療前后血清IGF-1水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療后3個月血清IGF-1水平顯著高于治療后1個月和治療后2個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 治療前后GHD患兒的血清IGF-1水平變化情況

2.4治療后GHD患兒的rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型臨床基線資料比較 根據(jù)GHD患兒rs66593747基因位點(diǎn)差異情況分為3組，其中該位點(diǎn)的基因為鳥嘌呤-鳥嘌呤(GG)的為GG組，基因為鳥嘌呤-胸腺嘧啶(GT)的為GT組，基因為胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)的為TT組；3組的身高、體質(zhì)量、骨齡及IGF-1水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，年齡、性別及BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 治療后GHD患兒的rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型臨床基線資料比較

2.5GHD患兒的rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型身高增長情況比較 3組治療期間月身高增長長度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，GT組月身高增長量顯著高于其他2組，GG組月身高增長量顯著高于TT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 GHD患兒的rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型身高增長情況比較

2.6rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型、IGF-1水平與rhGH療效的相關(guān)性分析 rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型與rhGH療效呈正相關(guān)，見表6。

表6 rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型、IGF-1水平與rhGH療效的相關(guān)性分析

3 討論

矮小癥是兒童常見的內(nèi)分泌疾病，該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與營養(yǎng)、睡眠、環(huán)境及遺傳因素等和內(nèi)分泌相關(guān)的諸多因素有關(guān)，矮小癥不僅影響兒童的軀體發(fā)育，還會造成心理陰影，因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對改善兒童身心健康極為重要[5]。臨床根據(jù)不同致病原因?qū)“Y分為GHD和特發(fā)性矮小癥等不同類型，生長激素分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙是引發(fā)GHD的主要原因。人體身高增長受骨生長因子和下丘腦促生長激素-生長激素-胰島素樣生長因子軸(GHRH-GH-IGF 軸)共同調(diào)節(jié)[6]。人體垂體前葉具有合成分泌生長激素的作用，當(dāng)該功能部分或完全缺失時，便會導(dǎo)致生長發(fā)育障礙性疾病，另外，當(dāng)生長激素分子及其受體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常時也會導(dǎo)致生長發(fā)育障礙，這是引發(fā)GHD的主要原因之一[7]。近年來，隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者認(rèn)為身高相關(guān)基因的多態(tài)性變化是人類身高的決定性因素，但大多數(shù)基因多態(tài)性研究主要集中在GHRH-GH-IGF 軸相關(guān)基因上，而與其他身高相關(guān)基因的研究報道較少[8-9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)之一，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞活力具有重要意義，應(yīng)激狀態(tài)下有助于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等的發(fā)育，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[10]。BBF2H7基因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，能夠通過特定機(jī)制加速軟骨基質(zhì)蛋白的分泌，同時可分泌至細(xì)胞外，促進(jìn)鄰近軟骨細(xì)胞增殖[11]。因此，研究BBF2H7基因多樣性與GHD的關(guān)系對了解該病的發(fā)病機(jī)制有重要意義。

rhGH是通過基因制藥工程生產(chǎn)的與人體內(nèi)生長激素結(jié)構(gòu)、作用相同的一種藥物，具有良好的促生長效應(yīng)，對脂質(zhì)代謝也有改善作用，是當(dāng)前治療矮小癥的主要治療藥物[12]。但rhGH治療的安全性存在爭議，有研究報道，該治療方法會增加惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險，具體機(jī)制尚不清楚[13]。影響rhGH治療療效的因素有年齡、骨齡、營養(yǎng)因素及遺傳因素等。本研究探究GHD患兒BBF2H7基因多態(tài)性rs66593747位點(diǎn)不同基因型與rhGH療效的關(guān)系，結(jié)果顯示，經(jīng)rhGH治療后，GHD患兒身高、體質(zhì)量、生長長度顯著提高，rs66593747基因位點(diǎn)3種基因型組間身高、骨齡及IGF-1水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，GT組GHD患兒在rhGH治療期間月身高增長長度最高，顯著高于GG組和TT組，GG組月身高增長長度顯著高于TT組，說明rs66593747基因位點(diǎn)的GT基因型GHD患兒經(jīng)rhGH治療后療效最好。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，rs66593747基因位點(diǎn)3種基因型與rhGH療效均呈相關(guān)性，且與GT基因型相關(guān)性最高，提示該基因型可作為rhGH治療療效的良好預(yù)測指標(biāo)。IGF-1是一種結(jié)構(gòu)與胰島素類似的多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，是生長激素發(fā)揮促生長作用的重要介導(dǎo)因子之一，生長激素更多的生長效應(yīng)通過該物質(zhì)來實現(xiàn)，且IGF-1無晝夜節(jié)律變化，因此常被用來反映機(jī)體生長激素分泌狀態(tài)，兒童rhGH治療過程需根據(jù)IGF-1水平調(diào)節(jié)rhGH劑量[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前GHD患兒IGF-1水平明顯低于正常對照組，rhGH治療后該指標(biāo)水平顯著上升，說明rhGH治療會升高機(jī)體IGF-1水平，并且治療后生長長度加快，提示兒童生長緩慢是由內(nèi)源性生長激素分泌不足所致；治療后3個月血清IGF-1水平高于治療后1個月和治療后2個月，說明隨著治療時間的延長，GHD患兒血清IGF-1水平會繼續(xù)升高，因此該指標(biāo)對評價rhGH治療療效有重要參考價值。

綜上所述，rhGH治療有助于提高GHD患兒IGF-1水平，rs66593747基因位點(diǎn)GT基因型rhGH治療療效優(yōu)于其他基因型，且rs66593747基因位點(diǎn)不同基因型與rhGH治療療效緊密相關(guān)。