美洲黑楊與小葉楊雜交F1代扦插無性系苗生長性狀動態(tài)分析

陳玉華，姚 丹，吳海楠，陶申童，吳吉妍，楊文國，童春發(fā)*

(1. 南京林業(yè)大學林學院，林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點實驗室，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037; 2.金陵科技學院動物科學與技術(shù)學院，江蘇 南京 210038)

美洲黑楊(Populusdeltoides)屬于楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)黑楊派，原產(chǎn)北美洲大陸中部和東部，是我國楊樹自然分布區(qū)中唯一缺乏的種，于20世紀70年代引入我國[1-2]。其樹干高大通直，樹皮光滑或縱裂，常灰白色；生長迅速,抗葉斑病能力強，但抗寒抗旱以及生根能力較差；材質(zhì)優(yōu)良，是我國短輪伐期工業(yè)用材經(jīng)營重要樹種，在商業(yè)化集約栽培人工林中占主體地位[3-4]。美洲黑楊種質(zhì)資源豐富，生長、形態(tài)等表型性狀在種源間、種源內(nèi)家系間以及家系內(nèi)無性系間等多個水平上存在廣泛的遺傳變異，成為楊樹選育改良的重要材料[5-6]，并基于此培育了很多生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的優(yōu)良品種，如南林系統(tǒng)、中林系統(tǒng)等的優(yōu)良無性系[3]。小葉楊(P.simonii)屬于楊柳科楊屬青楊派，是我國北方地區(qū)主要鄉(xiāng)土樹種和栽培樹種。幼樹皮灰綠色，老樹皮暗灰色、縱裂；芽細長，先端長尖；葉菱狀卵形、菱狀橢圓形或菱狀倒卵形，中部以上較寬，先端驟尖或漸尖，基部楔形、寬楔形或窄圓，具細鋸齒，無毛；葉柄圓，有毛或無毛。小葉楊有較強的抗旱、抗鹽堿、抗逆境能力，并且生根能力很強，種內(nèi)形態(tài)差異多樣，在林木各項抗性育種工作中成為世界性重要基因資源[7-8]。由于兩種楊樹無論在形態(tài)還是在生物學特性上都有很大的差異，因此兩者雜交所形成的F1代是研究楊樹重要數(shù)量性狀的很好材料。

楊樹分子育種中一項重要的基礎(chǔ)研究是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并在此基礎(chǔ)上識別控制重要數(shù)量性狀基因在基因組上的位置及其遺傳效應(yīng)的大小。為此，近二三十年以來有很多有關(guān)楊樹遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀基因位點(QTL)定位研究的報道[9-19]。在這些研究中，首先要建立一個作圖群體，也就是選擇兩個親本進行雜交獲得一個含有大量子代的雜交群體。然后，獲取群體中適當數(shù)量個體的分子標記和表型性狀數(shù)據(jù)，從而可以開展遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位的研究工作。楊樹作圖群體中子代一般都是實生苗，單株樹可能受到蟲害、風災(zāi)等因素的影響而折斷甚至死亡，因此群體中的個體數(shù)會逐年減少，一些即使存活的單株其表型性狀測量值也不準確，這會直接影響到QTL定位的準確性，也可能是過去一些楊樹生長性狀QTL定位研究中存在結(jié)果不一致現(xiàn)象的原因之一[9, 15, 17-18, 20]。為了解決這個問題，可以利用F1代的實生苗建立像楊樹無性系測定那樣的隨機區(qū)組試驗林[21-24]，不但可以達到以多個無性系單株來長期保存單個F1代實生苗基因型的目的，而且可以準確地測定實生苗后期表型性狀值，從而可以極大地提高楊樹QTL研究的精確性。

2009—2011年，本課題組建立了美洲黑楊×小葉楊雜交F1代作圖群體，于2017年利用已存活的子代個體建立了無性系隨機區(qū)組試驗林。本研究以美洲黑楊×小葉楊F1代的無性系試驗林，對其1年和2年生的扦插苗在不同生長階段的苗高和地徑進行了測定，采用多變量方差分析法分析不同無性系、不同區(qū)組生長性狀的差異性，使用隨機效應(yīng)模型估算不同時間點無性系重復力，利用聚類分析方法對不同無性系的苗高進行分類，以期發(fā)現(xiàn)F1代無性系生長性狀的變異規(guī)律，為后續(xù)利用該隨機區(qū)組試驗林進行QTL定位研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江蘇省句容市下蜀鎮(zhèn)南京林業(yè)大學實習林場(119°14′E，31°59′N)，氣候?qū)俦眮啛釒Ъ撅L氣候，年平均氣溫為15.2 ℃，極端最高氣溫為39.6 ℃，極端最低氣溫為16.7 ℃，日均氣溫高于10 ℃的植物生長期為226 d，總積溫4 859.6 ℃，年均日照2 157 h，平均無霜期233 d，年平均降雨量1 055.6 mm，年均空氣相對濕度79%。土壤為黃棕壤，土層深厚，質(zhì)地黏重，水養(yǎng)分條件中等。

1.2 試驗設(shè)計

試驗材料來自美洲黑楊×小葉楊雜交F1代群體。母本為美洲黑楊(南方型) ‘I-69’，父本為小葉楊。2009—2011 年連續(xù)3年對同樣的親本進行人工授粉雜交試驗，共獲得F1代苗木400 余株。2012 年春季移植到南京林業(yè)大學下蜀林場。2017年春選取生長良好的234株美洲黑楊×小葉楊F1代個體，采集朝向一致、年齡相同(2年以下)、粗度1～2 cm、長度18～20 cm的枝條，進行扦插。扦插按完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，3次重復，每小區(qū)1個無性系，每無性系6株2行，株行距50 cm×60 cm，共計扦插4 212個插條。2017年6月8日開始對苗高進行觀測，其后每隔約15 d 觀測1次，直至2017年10月14日所有苗木駐芽為止，對苗高共進行了8次觀測。2018年5月24日開始每隔約20 d觀測1次，對苗高共進行了7次觀測。2017和2018年底，對每株樹的地徑各測量1次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

美洲黑楊×小葉楊F1代無性系苗高和地徑以單株測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。在統(tǒng)計分析前，對原始數(shù)據(jù)進行異常值查找、剔除，運用R語言對每年多次觀測的苗高數(shù)據(jù)繪制散點連線圖，刪除由于死亡或風折等原因造成苗高沒有隨時間增加而增長的單株數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對兩個生長性狀數(shù)據(jù)進行多變量方差分析，利用HalfsibSS 1.0軟件[25]計算無性系重復力，使用R語言包Hclust根據(jù)無性系在多個時間點的效應(yīng)對無性系進行聚類分析。

多變量方差分析和重復力計算使用如下線性模型：

yijkt=μt+Bit+Fjt+BFijt+eijkt。

(1)

在進行無性系聚類分析時，首先將模型(1)視作固定效應(yīng)模型,并考慮如下約束條件：

(2)

計算出各個無性系效應(yīng)的最佳線性無偏估計[26]。然后根據(jù)無性系在多個時間點的效應(yīng)值，采用歐式距離計算無性系間的距離，類間距離采用系統(tǒng)聚類法中的Ward法(離差平方和法)，通過R語言軟件Hclust函數(shù)實現(xiàn)聚類分析，同時調(diào)用Plot函數(shù)繪制扇形聚類圖。根據(jù)肘部法則(Elbow method)確定參試無性系分類的個數(shù)[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲黑楊小葉楊F1代無性系苗高、地徑的方差分析

圖1 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系隨機區(qū)組試驗林2年生苗高和地徑直方圖Fig.1 Histograms for the tree height and ground diameter in the clonal randomized block testforest derived from the F1 progeny of Populus deltoides×P. simonii

表1 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系隨機區(qū)組試驗林苗高和地徑多變量方差分析

2.2 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系試驗林苗高和地徑變異參數(shù)

美洲黑楊×小葉楊F1代無性系在扦插后2年中若干個生長時間點苗高和地徑變異參數(shù)如表2所示。可以看出，在2年連續(xù)觀測中，苗高總體平均值從34.67 cm逐漸增長至317.44 cm，標準差從11.08 cm逐漸增長至60.97 cm，變異范圍從極差76.7 cm逐漸增長至425.0 cm，變異系數(shù)從31.96%逐漸降低至19.21%。表明隨著樹木月齡的增長，美洲黑楊×小葉楊F1代無性系苗高變異絕對值在增大，但相對值在減小。地徑2年的總體平均數(shù)分別為1.50 cm和2.02 cm，變化范圍極差分別為2.90 cm和3.58 cm，標準差分別為0.40 cm和0.53 cm，變異系數(shù)分別為26.66%和26.20%，說明地徑也是隨著樹齡的增長，變異絕對值在增大，但相對值在減小，與苗高表型變異趨勢基本上一致。

從表2還可以看出，隨著樹齡的增長，苗高重復力先逐漸減小，并在2018年度第1次測量時達最低值0.398，而后又隨著樹齡的增長而逐漸增大?？偟膩碚f，苗高重復力變動范圍為0.398～0.689，說明美洲黑楊×小葉楊F1代無性系苗高受遺傳因素的影響在不同生長時期不是固定不變的，有一定變動幅度，基本上受到中等強度以上的遺傳因素控制。地徑的重復力值2017年較2018年低，分別為0.376和0.594，表明隨著時間的變化，地徑同苗高一樣受到中等程度以上遺傳因素的影響。

表2 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系隨機區(qū)組試驗林苗高和地徑生長性狀變異

2.3 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系苗高聚類分析

為了揭示無性系間生長性狀的變異，分別對2017和2018年無性系效應(yīng)最佳線性無偏估計值進行了聚類分析。根據(jù)肘部法則(Elbow method)，2017年觀測的190個無性系和2018年觀測的139個無性系均分為8個類較適宜(表3)。圖2A和圖2B分別顯示了2017和2018年觀測的無性系的扇形聚類圖，可以清楚地看出每一個無性系具體屬于何種聚類。雖然2018年觀測的139個無性系包含在2017年的190個無性系之中，但是2018年的無性系每個聚類不是完全包含在2017的某個聚類之中。表3給出了2017和2018年無性系兩兩聚類間共有的無性系數(shù)目以及2018年每個類中無性系的數(shù)目。例如，2018年的第一個類(CL1)中的28個無性系分別來自2017年的CL1、CL2、CL3、CL4和CL6類，其共有的無性系數(shù)目分別為6、1、9、8和4；其他類的無性系至少來自2017年的兩個聚類，只有第8類來自2017年的1個聚類，因為該類只有1個無性系。

圖2C顯示了2017年在8個時間點觀測的無性系每個聚類均值效應(yīng)散點連線圖。發(fā)現(xiàn)第2、7和8類的無性系均值效應(yīng)隨時間延長明顯地增加，其中第8類(CL8)在各個時間點的效應(yīng)都是最大的。與其相反，第1、3和5類的無性系均值效應(yīng)隨時間明顯地下降，其中第5類下降最多。此外，發(fā)現(xiàn)第6類的均值效應(yīng)在前6個觀測時間點基本上平緩略微為負，但是在后2 次觀測時間點則逐漸增加變?yōu)檎?yīng)；第4類均值效應(yīng)的變化趨勢則第6類恰恰相反，在前6個觀測時間點基本上平緩略微為正，而在后2次時間點逐漸下降變?yōu)樨撔?yīng)。

圖2D顯示了2018年在7個時間點觀測的無性系每個聚類均值效應(yīng)散點連線圖。雖然有4個類的均值效應(yīng)在各個時間點均為負值，而另外4個類的效應(yīng)均為正值，但是同2017年的類均值效應(yīng)變化趨勢明顯不同，有7個類的均值效應(yīng)隨著時間變化比較平緩，只有第8類比較特殊只含有一個無性系，其效應(yīng)前期隨時間而增加而后期也比較平緩。

表3 2017和2018年無性系分類間共有無性系數(shù)目

圖2 美洲黑楊×小葉楊F1代無性系苗高聚類分析Fig.2 The clustering analysis of clones from the F1 progeny of P. deltoides × P. simonii

3 討 論

本研究所建立的楊樹無性系隨機區(qū)組試驗林為楊樹數(shù)量性狀基因定位研究提供了一個很好的遺傳作圖材料。由于每一個無性系在區(qū)組內(nèi)和小區(qū)內(nèi)都有重復，使得1個無性系在群體中有超過10個單株，而每個無性系代表1個實生苗的基因組，因此這樣的作圖群體可以最大限度地保存每個子代的基因組信息，免受因自然災(zāi)害造成作圖群體中子代基因組類型的減少。另一方面，由于無性系有多個重復的單株，使得它所代表的實生苗表型性狀值可以有多個重復的測量值，因此使用這些無性系來進行QTL定位會更加準確。但是，在動植物育種研究中，傳統(tǒng)的遺傳作圖群體為自交系中的回交(BC)和F2代群體，或是異交群體中的雜交F1代群體，一般使用類似于林木雜交F1代中實生苗的個體以及區(qū)間作圖(interval mapping)[33]或復合區(qū)間作圖(composite interval mapping)[34]等統(tǒng)計分析方法[18, 35-36]來進行QTL定位研究，這些統(tǒng)計方法不能直接用于本研究所述的楊樹無性系隨機區(qū)組試驗林作圖群體。因此，針對本次研究所建立的楊樹無性系試驗群體，依據(jù)對該群體所獲得遺傳分析的結(jié)果，后續(xù)要建立相應(yīng)的統(tǒng)計方法用于QTL定位或進行全基因組關(guān)聯(lián)分析[37-39]，這將有助于楊樹數(shù)量性狀基因定位的精確性，從而加速楊樹分子育種的進程。