精氨酸等物質(zhì)對紫色紅曲菌產(chǎn)Monacolin K及紅曲色素的影響

朱倩倩，張 函，王海蛟，李穎慧，焦 梓，石嘉辰，王成濤,2，張 嬋,2，*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048,2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048)

紅曲歷史悠久，盛產(chǎn)于福建，最為著名的是古田紅曲，常應(yīng)用于黃酒釀造、食品發(fā)酵以及色素生產(chǎn)等領(lǐng)域[1-2]。紅曲菌發(fā)酵可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，如Monacolin K[3]、紅曲色素[4]、γ-氨基丁酸[5]以及真菌毒素桔霉素[6]等，紅曲色素是紅曲菌在次級代謝過程中產(chǎn)生的一種由多種聚酮化合物組成的混合物[7]。天然紅曲色素具有抗菌、抗氧化等生物活性，具有廣泛的應(yīng)用前景。

Monacolin K也是一種有益的次級代謝產(chǎn)物，是具有生理活性的聚酮類物質(zhì)，1979年日本遠(yuǎn)藤章教授在紅色紅曲菌(Monascusruber)發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其可以減少膽固醇合成[8]。但由于Monacolin K產(chǎn)量較低，極大限制了紅曲菌的應(yīng)用。目前提高Monacolin K產(chǎn)量的方法主要有2種：一是通過優(yōu)化發(fā)酵條件或者改進培養(yǎng)基組分[3]；二是通過基因工程手段，如基因敲除及過表達(dá)等方法[9-10]。

實驗前期以野生型菌株M1為實驗菌株，通過在培養(yǎng)基中添加谷氨酸，發(fā)現(xiàn)Monacolin K產(chǎn)量提高了3.5倍[11]。利用HPLC-MS檢測代謝物，進行非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)添加和未添加谷氨酸的2組發(fā)酵液樣本中共檢測到上千種差異代謝物，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(FC>2、P<0.05、VIP>1)，最終篩選到可能與次級代謝產(chǎn)物Monacolin K的合成有關(guān)的10種物質(zhì)，分別是精氨酸、L-蘋果酸、D-葡萄糖、煙酰胺、α-酮戊二酸、苯丙氨酸、賴氨酸、焦磷酸硫胺素、黃素單核苷酸、L-乳酸。因此基于前期研究工作，選擇這10種物質(zhì)進行發(fā)酵實驗，檢測其對紫色紅曲菌中Monacolin K和紅曲色素產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)M1，北京工商大學(xué)實驗室保存。PDA、葡萄糖、豆粕粉、甘油、蛋白胨、KH2PO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O，北京半夏科技發(fā)展有限公司；色譜級甲醇、無水乙醇、獨立濾器、0.45 μm濾器，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；Monacolin K(純度≥98%)，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A型紫外檢測器、UV-2450 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；M-pact AX124 型分析天平，上海歡奧科技公司；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SU8010 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基(g/L)[12]: PDA 37、瓊脂5。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30、大豆粉15、蛋白胨10、甘油70、KH2PO42、NaNO32、MgSO4·7H2O 1。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油90、大米粉20、蛋白胨10、KH2PO42.5、NaNO35、MgSO4·7H2O 1、ZnSO4·7H2O 2。

實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：在原始發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基礎(chǔ)上分別添加精氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)、L-蘋果酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)、D-葡萄糖(質(zhì)量濃度10、20、30 g/L)、煙酰胺[14](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%)、α-酮戊二酸[15](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%)、苯丙氨酸(質(zhì)量濃度1、2、3 g/L)、賴氨酸[16](質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)、焦磷酸硫胺素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%)、黃素單核苷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%、0.6%)和L-乳酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%)。

1.3.2菌種培養(yǎng)

將M1菌株在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d，活化2代，用接種環(huán)從培養(yǎng)基上刮取1環(huán)菌液到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。M1菌株在種子液中培養(yǎng)24 h，顏色變?yōu)闇\粉色后，將種子液按10%的接種量分別接到原始發(fā)酵培養(yǎng)基(對照組)、精氨酸-發(fā)酵培養(yǎng)基、L-蘋果酸-發(fā)酵培養(yǎng)基等10種實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基中。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d。檢測各培養(yǎng)基中Monacolin K及紅曲色素產(chǎn)量，進而確定最佳添加物。

1.3.3色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為0.1% 磷酸水溶液、甲醇(體積比1∶3)，流速1 mL/min；檢測器為紫外檢測器，檢測波長237 nm，檢測溫度30 ℃，進樣量10 μL。

1.3.4Monacolin K產(chǎn)量測定

發(fā)酵液的預(yù)處理：取對照組和實驗組發(fā)酵液各5 mL，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)75%的甲醇，超聲萃取30 min，靜置過夜，取上清液經(jīng)0.45 μm的有機濾膜過濾，參考王蘭[17]方法檢測濾液中Monacolin K含量。將Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成5、20、50、80、100、150、200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后經(jīng)HPLC檢測后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸曲線方程，計算樣品中Monacolin K含量。

1.3.5色價的測定

取發(fā)酵液5 mL，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，于恒溫水浴鍋60 ℃浸提1 h，靜置。用分光光度計測定410、448、505 nm處吸光度[18]。根據(jù)式(1)計算色價(U/mL)。

紅曲色素色價=OD505/448/410×稀釋倍數(shù)。

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin軟件對數(shù)據(jù)進行處理，每組樣品進行3次平行實驗，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Monacolin K產(chǎn)量分析

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸曲線方程，計算樣品中Monacolin K含量。其中橫坐標(biāo)(x)為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)(y)為峰面積，R為相關(guān)系數(shù)，得到的回歸方程為y=32 821x-57 678,R2=0.998。圖1顯示Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間在22.9 min左右。

2.1.2Monacolin K產(chǎn)量測定結(jié)果

添加不同物質(zhì)發(fā)酵后Monacolin K產(chǎn)量變化如圖2。精氨酸、煙酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸以及黃素單核苷酸的添加對Monacolin K產(chǎn)量提高的效果較好。分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、0.5%和0.6%的精氨酸時，第8天Monacolin K產(chǎn)量分別提高至對照組的2.66、2.86和3.65倍，達(dá)到了193.1、207.6、265.1 mg/L；而第15天的Monacolin K產(chǎn)量分別提高至2.72、2.24和2.89倍，達(dá)到了428.0、351.9、455.3 mg/L。當(dāng)苯丙氨酸添加量為2 g/L時，第15天的Monacolin K產(chǎn)量與對照組相比提高至1.39倍；而添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的賴氨酸時，Monacolin K產(chǎn)量提高至1.37倍，推測發(fā)酵液中添加有機氮源的效果比無機氮源好。柴詩緣等[18]在紅曲菌中添加山藥粉、谷氨酸等10種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸后可極顯著提高Monacolin K的產(chǎn)量，提高了5.60倍，也說明了氨基酸類物質(zhì)的添加有助于Monacolin K的產(chǎn)生。當(dāng)煙酰胺添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，其Monacolin K產(chǎn)量在第15天提高到324.0 mg/L，相比于原始培養(yǎng)基提高至2.06倍。但是煙酰胺添加量增加后，反而對Monacolin K有抑制作用。黃素單核苷酸添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時，第15天的Monacolin K提高至1.76倍。添加不同量的L-蘋果酸、D-葡萄糖、焦磷酸硫胺素以及L-乳酸時，結(jié)果與對照組沒有明顯差異。α-酮戊二酸的添加反而降低了Monacolin K產(chǎn)量，對Monacolin K合成有抑制作用，推測α-酮戊二酸的積累抑制了乙酰輔酶A的合成，進而抑制了Monacolin K的產(chǎn)生。

**表示實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))是由一系列酶促反應(yīng)組成的循環(huán)反應(yīng)體系，由乙酰輔酶A 與草酰乙酸的縮合反應(yīng)作為起始反應(yīng)[19]。由于乙酰輔酶A作為TCA循環(huán)與Monacolin K合成的共同關(guān)鍵物質(zhì)，推測TCA循環(huán)與Monacolin K的調(diào)控途徑在很大程度上互相影響。而L-蘋果酸、α-酮戊二酸參與三羧酸循環(huán)，因此通過這2種物質(zhì)添加可以判斷L-蘋果酸、α-酮戊二酸對Monacolin K的影響。同時焦磷酸硫胺素是α-酮戊二酸氧化脫羧酶系的輔酶，也參與TCA循環(huán)，因此通過焦磷酸硫胺素的添加，可探究焦磷酸硫胺素對Monacolin K的影響。紅曲液態(tài)發(fā)酵需要碳源和氮源，D-葡萄糖是有機碳源，而添加的精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等氨基酸類可以作為有機氮源促進紅曲菌的生長代謝及次級代謝產(chǎn)物的生成。煙酰胺是NADH和NADPH合成的前體物質(zhì)，在臨床上也應(yīng)用于高血壓患者的治療。黃素單核苷酸是氧化還原酶的輔基，能夠參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝。L-乳酸則可以在乳酸脫氧酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)楸徇M而被氧化生成Monacolin K合成前體物質(zhì)-乙酰輔酶A。

與紅曲菌固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K更適用于大批量生產(chǎn)，也更節(jié)約成本和空間，但是紅曲菌產(chǎn)生的Monacolin K產(chǎn)量較低，一些學(xué)者從發(fā)酵液營養(yǎng)成分的角度來提高Monacolin K產(chǎn)量。趙薇等[20]在叢毛紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中通過添加不同來源的碳源來探討對Monacolin K產(chǎn)量的影響，研究發(fā)現(xiàn)：添加生物柴油粗甘油和脂肪醇粗甘油，Monacolin K產(chǎn)量較對照組提高10.6倍。劉麗等[21]在紅曲菌發(fā)酵液中添加800 μmol/L水楊酸和150 μmol/L茉莉酸甲酯后，發(fā)現(xiàn)Monacolin K分別增加了66.0%和64.5%。邱源等[22]在培養(yǎng)基中添加Zn2+，發(fā)現(xiàn)對Monacolin K產(chǎn)量提高效果最為顯著。黃勛等[23]采用發(fā)芽大豆并2種紅曲菌共發(fā)酵，在發(fā)酵第3天加入釀酒酵母破壁液，對Monacolin K產(chǎn)量提高效果較好。他們分別是通過添加營養(yǎng)因子、信號分子以及加速細(xì)胞壁破裂等方式促進Monacolin K的產(chǎn)生。而本研究是通過非靶向代謝組學(xué)分析后，推測Monacolin K合成通路中可能的相關(guān)物質(zhì)會對Monacolin K合成有一定影響，進而去驗證這些物質(zhì)對Monacolin K等次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

2.2 紅曲色素色價分析

2.2.1紅色素檢測結(jié)果

賴氨酸以及黃素單核苷酸的添加對紅曲紅色素合成具有促進作用，見圖3。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%和0.3%的賴氨酸在發(fā)酵第8天可使紅色素產(chǎn)量提高至2倍以上，第15天的產(chǎn)量分別提高為對照組的1.36倍和1.33倍；添加黃素單核苷酸后，第15天的紅色素產(chǎn)量分別提高至對照組的1.84、1.54、1.71倍，達(dá)到了35.60、29.80、33.03 U/mL。當(dāng)精氨酸添加量為0.4%時，第15天其紅色素相對于對照組提高至1.27倍。L-蘋果酸、D-葡萄糖、苯丙氨酸、焦磷酸硫胺素和L-乳酸的添加對紅色素?zé)o明顯促進作用。而添加煙酰胺和α-酮戊二酸后對紅色素合成具有抑制作用。

**表示實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2橙色素檢測結(jié)果

賴氨酸、苯丙氨酸以及黃素單核苷酸的添加對橙色素合成具有促進作用，見圖4。其中黃素單核苷酸的效果最好，在紅曲菌發(fā)酵液中添加后，發(fā)酵第15天橙色素產(chǎn)量分別提高至對照組的2.98、2.51和2.72倍，達(dá)到了42.84、36.09、39.24 U/mL。賴氨酸的添加也使第8天橙色素產(chǎn)量提高至1.5～2.0倍。添加2 g/L的苯丙氨酸使橙色素的產(chǎn)量在第15天較對照組提高至1.2倍左右。D-葡萄糖、焦磷酸硫胺素的添加對橙色素含量無明顯提高，而L-蘋果酸和煙酰胺的添加對橙色素的產(chǎn)生有抑制作用。

**表示實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3黃色素檢測結(jié)果

苯丙氨酸、賴氨酸以及0.5%和0.6%的黃素單核苷酸的添加對黃色素合成有促進作用，見圖5。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%的賴氨酸后第8天的黃色素產(chǎn)量分別為46.94、55.67、55.35 U/mL，提高至對照組的1.51、1.80、1.79倍。苯丙氨酸的添加主要在發(fā)酵后期起促進作用，添加質(zhì)量濃度為2 g/L和3 g/L的苯丙氨酸在第15天的黃色素產(chǎn)量提高至1.23倍和1.46倍。煙酰胺、L-蘋果酸以及α-酮戊二酸的添加對黃色素的產(chǎn)生具有抑制作用；精氨酸、焦磷酸硫胺素和L-乳酸3種物質(zhì)的添加對黃色素的產(chǎn)生影響不大。

**表示實驗組與對照組差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

通過對紅曲色素的檢測發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸、賴氨酸和黃素單核苷酸可以大幅提高紅曲色素產(chǎn)量。張斌等[24]曾探究20種氨基酸的添加對紅曲色素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精氨酸對紅曲色素的產(chǎn)生促進效果不明顯，而苯丙氨酸和賴氨酸對紅曲色素具有促進作用，與本研究結(jié)果一致。朱曉萍等[25]將茶多酚作為一種調(diào)控因子添加到紅曲菌發(fā)酵液中，發(fā)現(xiàn)紅曲色素總色價提高1.03倍，黃色素比例提高了7.4%。王艷等[26]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配方為葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 值4.5時，紅曲色素色價比優(yōu)化前提高了3.13倍。紅曲色素具有良好的穩(wěn)定性、耐熱性、耐光性且安全無毒，在食品添加劑、紡織品、化妝品和藥品等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[27]；因此，對紅曲色素產(chǎn)量提高的研究也具有重要意義。

3 結(jié) 論

本研究通過在紫色紅曲菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加精氨酸等10種物質(zhì)，探究了這些物質(zhì)對于Monacolin K產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)精氨酸、煙酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸以及黃素單核苷酸對Monacolin K產(chǎn)量具有促進作用。其中添加精氨酸后促進效果最好，第15天的產(chǎn)量可達(dá)到455.3 mg/L，提高至原始培養(yǎng)基的2.89倍；其次為煙酰胺，提高至2.06倍，但前期煙酰胺對于Monacolin K的產(chǎn)生具有抑制作用。在提高Monacolin K產(chǎn)量的同時，賴氨酸、苯丙氨酸和黃素單核苷酸對紅曲色素的產(chǎn)生也有促進作用。關(guān)于精氨酸等物質(zhì)添加影響紅曲菌產(chǎn)Monacolin K的作用機制還有待于進一步研究。