人源單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組進(jìn)化及耐藥性分析

姚 廣, 陸玉穎, 張慶華, 朱海霞, 陳益?zhèn)? 孫 東, 莊 振, 張 峰, 劉 鼎, 宋 治

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

單 核 細(xì) 胞 增 生 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes，LM）是一種廣泛存在于土壤和飼料中的革蘭陽(yáng)性桿菌，被列為20 世紀(jì)90 年代四大食源性疾病致病菌之一。LM 主要通過(guò)糞-口途徑感染，還可通過(guò)眼及破損皮膚和黏膜進(jìn)入人體而造成感染［1］。細(xì)菌侵入血液后，可通過(guò)破壞的血腦屏障導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，引起腦膜炎、腦膜腦炎、腦膿腫或腦積水形成［2-4］。菱腦炎（腦干腦炎）是LM 腦炎的一種特殊形式，主要影響腦干和小腦，是老年人細(xì)菌性腦膜腦炎的第三大常見(jiàn)病因，僅次于肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌。全球每年人類感染LM 的發(fā)病率為（0.2～7.4）/1 000 000，死亡率達(dá)20%～70%。目前，LM 感染已成為世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［5］，國(guó)內(nèi)具體的發(fā)病情況和致死率還未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)探討1 例腦膜炎患者病情迅速進(jìn)展、治療失敗的原因，闡明LM的基因組特征、功能及耐藥機(jī)制，為臨床提高該病早期診斷率和進(jìn)行有效治療提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料患者，男性，51 歲。因發(fā)熱、頭痛7 d，加重伴意識(shí)障礙2 d，于2017 年8 月9 日入中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。既往體健。入院時(shí)格拉斯哥昏迷指數(shù)（GCS）評(píng)分11/15（E3V3M5）。腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查可見(jiàn)胞內(nèi)革蘭陰性桿菌。入院后予以經(jīng)驗(yàn)性美羅培南+萬(wàn)古霉素+大劑量青霉素治療，癥狀仍進(jìn)行性加重，入院后第3 天GCS 評(píng)分降至6/15（E1V2M3），第5 天突發(fā)呼吸驟停、雙瞳散大，予以急診側(cè)腦室穿刺后仍搶救無(wú)效，最終死亡。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)取患者腦脊液2 mL，3 000 r·min－1離心沉淀15 min，用移液槍取管底沉淀液放入預(yù)先配制的10 mL 無(wú)菌李斯增菌肉湯（LB）中，并置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用接種環(huán)將LB 增菌液劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從血瓊脂平板上挑取菌落進(jìn)一步行革蘭染色鏡檢和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-FOF-MS）鑒定。菌落革蘭染色：可見(jiàn)成簇的革蘭陽(yáng)性桿菌，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為L(zhǎng)M，藥敏實(shí)驗(yàn)報(bào)告對(duì)氨芐西林、青霉素和復(fù)方新諾明敏感。見(jiàn)圖1。

1.3 菌株基因組提取和全基因測(cè)序從該例患者腦脊液中分離得到菌株，常規(guī)QIAGEN 試劑盒提取全基因組DNA，安捷倫2100 片段分析系統(tǒng)定量后，按美國(guó)illumina 公司基因組測(cè)序流程構(gòu)建基因組文庫(kù)，質(zhì)控后通過(guò)Illumina HiSeq 3000 系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌De novo 測(cè)序，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析處理。

1.4 基因組拼接及基因組注釋從原始數(shù)據(jù)中過(guò)濾出低質(zhì)量數(shù)據(jù)，進(jìn)行初始組裝，并通過(guò)SOAPdenovo2 獲得連續(xù)序列。SSPACE 獲得整段序列，并定位組裝評(píng)估基因組質(zhì)量。比較從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI） 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的該物種蛋白質(zhì)序列信息和BLAST 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因。用tRNAScan-SE 軟件鑒定轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（transfer RNA，tRNA） 特征，用RNAmmer 軟件鑒定核糖體RNA。利用基因本體（gene ontology，GO） 數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行功能聚類分析。

1.5 基因組分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)LM EDG-e 菌株（NC-u003210.1）為參考基因組，利用BLAST 軟件比較法對(duì)38 個(gè)菌株和樣品的基因組進(jìn)行進(jìn)化分析，用最大似然值構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 耐藥基因分析在菌株的基因組上定位了4 個(gè)耐藥基因，包括lmo1250（抗生素耐藥蛋白基因）、lmo2355 （多藥耐藥蛋白基因）、lmo1712（多藥耐藥蛋白基因）和lmo0839（四環(huán)素耐藥蛋白基因），以細(xì)菌基因組序列為基礎(chǔ)，通過(guò)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）定位和分析，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析該菌株發(fā)生的耐藥性突變。

2 結(jié) 果

2.1 臨床檢查結(jié)果磁共振成像液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù) 序 列 （fuild attenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR）（圖1A 和B）顯示：患者延髓和中腦有高信號(hào)病灶（黑色箭頭），雙側(cè)側(cè)腦室和第三腦室體積增大，室管膜明顯強(qiáng)化，考慮感染繼發(fā)腦積水并間質(zhì)性腦水腫（白色箭頭）。瑞氏-吉姆薩染色的腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示：嗜中性粒細(xì)胞比例明顯升高，激活的單核細(xì)胞中可見(jiàn)多條胞內(nèi)桿菌（黑色箭頭，圖1C）。細(xì)菌培養(yǎng)可見(jiàn)灰白色、中等大小和半透明的圓形凸起的LM 菌落（圖1D）。將培養(yǎng)的LM 菌落涂片進(jìn)行革蘭染色，顯示為革蘭陽(yáng)性桿菌（圖1E）。

2.2 LM 基因組的組裝對(duì)培養(yǎng)菌株的基因組進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，該菌株基因組大小約3 008 507 bp，GC 含量為38.06%，共有31 個(gè)scaffolds，命名為XY1803。對(duì)基因組質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估后，錯(cuò)率為0.01% （374 bp）（表1）。 利 用tRNAScan-SE、RNAmmer 和GeneMark 軟件對(duì)組裝的基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了3 001 個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列（coding sequences，CDSs），平均長(zhǎng)度為300 個(gè)氨基酸。3 001 個(gè)編碼蛋白序列中有252 種編碼序列，3 種 核糖體RNA （ribosomal RNA，rRNA）和45 種tRNA。

圖1 LM 腦膜炎患者的影像學(xué)資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果Fig.1 Imaging and laboratory findings of patient with LM meningitis

表1 細(xì)菌基因組測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中耐藥基因注釋的比較Tab. 1 Comparison of sequencing results of bacterial genome and drug-resistance gene annotation in database

2.3 基因注釋與分析將預(yù)測(cè)的3 001 個(gè)基因與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，并通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)聚類分析，結(jié)果表明：與LM 基因組一致率為88%，將基因 序 列 分 別 與 SWISS-PROT、 TREMBL、PFAM、NR 和KOG 庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，取相似度≥30%、e 值≤1e-5 的注釋，合并得到的所有注釋詳細(xì)信息?；虻墓δ茴悇e包括信息儲(chǔ)存與處理、細(xì)胞周期與信號(hào)傳遞和細(xì)胞能量代謝等（圖2）。

圖2 GO 聚類結(jié)果Fig.2 Results of GO classification

2.4 基因組學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化分析繼續(xù)對(duì)培養(yǎng)菌株進(jìn)行基因組學(xué)分析，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株EDG-e 為參考，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了38 個(gè)具有代表性的LM 基因組。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)典人源LM 標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e 和Finland1998 均位于進(jìn)化譜系Ⅰ中，而EDG-e 屬于實(shí)驗(yàn)室菌株1/2a 血清型；Finland1998 菌株為血清型3a，起源于芬蘭相關(guān)疫情；本研究分離的菌株XY1803 與從美國(guó)食品加工環(huán)境中分離的FSL N1-017 菌株（血清型4b，譜系Ⅱ）和從美國(guó)散發(fā)的患者中分離的SLCC2540（血清型3b，譜系Ⅱ）基因組進(jìn)化結(jié)構(gòu)相似（圖3），但基因組序列的一致性也小于88%，約有3 000 bp的基因組序列不一致，認(rèn)為是系譜Ⅱ中一個(gè)新的分型。

圖3 LM 進(jìn)化圖Fig.3 Evolution of LM

2.5 細(xì)菌的耐藥性分析通過(guò)對(duì)菌株XY1803 基因組3 001 個(gè)注釋基因分析，發(fā)現(xiàn)了已有報(bào)道的耐藥 基 因，包 括 mdtG、 norB、 norC、 lmrP、TC. MATE、 SLC47A、 norM、 mdtK、 dinF、lmrB、mdtG、tetA 和sugE，見(jiàn)表1。在KEGG 聚類分析中，耐藥基因主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、質(zhì)膜和膜的組成部分。細(xì)菌基因組中的4 個(gè)耐藥基因與EDG-e 基因組進(jìn)行配對(duì)，分別為XY1803-51、XY1803-770、XY1803-2796和XY1803-1997（圖4）。4 個(gè)基因長(zhǎng)度約1 000 bp，SNP 均小于90%，匹配率 大 于92%。XY1803_51 比 對(duì)lmo0519，SNP 為25； XY1803_2796 比 對(duì) lmo1712，SNP 為 53；XY1803_770 比 對(duì)lmo1250，SNP 為82；XY1803_1997 比對(duì)lmo2355，SNP 為89。

3 討 論

圖4 耐藥基因的突變位點(diǎn)圖Fig.4 Location map of resistance gene mutation

LM 感染被認(rèn)為是最嚴(yán)重的細(xì)菌食源性感染之一，一旦累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在合理抗感染治療的基礎(chǔ)上其死亡率仍高達(dá)30%［6］。因此，在臨床上快速鑒定出菌株類型，結(jié)合藥敏結(jié)果選擇敏感的抗生素進(jìn)行及早治療是救治成功的關(guān)鍵。然而，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)LM 感染，腦脊液培養(yǎng)和血培養(yǎng)呈陽(yáng)性的患者不足50%［7］。培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低和藥敏實(shí)驗(yàn)的不確定性是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)LM 感染患者死亡率和致殘率高的重要原因。通過(guò)新一代的測(cè)序技術(shù)，可以準(zhǔn)確、快速（3 d 內(nèi)）明確病原體類型，并通過(guò)準(zhǔn)確分析和注釋細(xì)菌的基因組［8-11］完成菌株分型和耐藥性分析，從而使及早制定針對(duì)性的敏感抗生素治療方案成為可能。

根據(jù)細(xì)菌基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析，LM 可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4 個(gè)譜系。譜系Ⅰ菌株通常從人類臨床病例中分離出來(lái)，其中多數(shù)為血清型4b，是LM 感染暴發(fā)的主要原因。譜系Ⅱ菌株通常是從食物和環(huán)境中分離出來(lái)的，血清型以1/2a 為主，主要引起反芻動(dòng)物感染，極少導(dǎo)致人類致?。?2-13］。本研究對(duì)該例腦膜炎患者腦脊液中培養(yǎng)的LM 菌株XY1803 進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示：該菌株屬于Ⅱ譜系，與SLCC2540 菌的親緣關(guān)系更為密切。SLCC2540 菌株已有少量報(bào)道能夠?qū)е吕钏固鼐腥拘约膊?，本研究結(jié)果表明：牧產(chǎn)品食物源性的LM 也具有強(qiáng)烈的人疾病感染性，不能單純依靠血清型分析判斷致病性，需要進(jìn)行全基因組測(cè)序進(jìn)行病原微生物溯源。

同時(shí)，本文作者通過(guò)對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行注釋 發(fā) 現(xiàn) MDTG、 NORB、 NORC、 LMRP、TC.MATE、SLC47A、NORM、MDTK、DINF、LMRB、MDTG、TETA 和SUGE 等與耐藥性相關(guān)的基因；EggNOG 分類分析結(jié)果顯示：上述基因與［P］ ENOG410XNN3 耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)體emrb-qaca 亞家族、［G］糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝和［P］ENOG410XSK2多藥耐藥蛋白mdtH 等細(xì)菌耐藥機(jī)制有關(guān)聯(lián)。在相關(guān)基因的KEGG 聚類注釋中，上述耐藥基因與K18926 菌株的ermb、mdth 及DHA2 基因家族、膜鋅組分和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性有關(guān)，分別屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）轉(zhuǎn)運(yùn)體、DHA1 家族和多藥耐藥蛋白［14-15］。MFS是主要的二級(jí)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，與細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換和能量代謝有密切關(guān)聯(lián)。上述耐藥相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于臨床抗感染藥物的選擇具有重要的指導(dǎo)意義。

此外，本研究還預(yù)測(cè)出與耐藥基因相匹配的基因變異，是量化LM 耐藥程度的一個(gè)重要指標(biāo)。細(xì)菌基因組中的4 個(gè)耐藥基因SNPs 均小于90%，匹配率大于92%，本文作者認(rèn)為該菌株具有中度耐藥性，并未發(fā)生大范圍的耐藥性基因突變。LM 的胞內(nèi)特性使其難以有效治療。青霉素、阿莫西林和氨芐西林等能夠與LM 細(xì)胞膜上青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding protein，PBP） 中的青霉素結(jié)合蛋白3（penicillin-binding protein-3，PBP-3） 高親和力結(jié)合，被細(xì)胞吸收后儲(chǔ)存在胞質(zhì)中，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是臨床一線用藥［16］。復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和哌拉西林等雖有不同程度耐藥性報(bào)道，但也均可作為臨床選擇用藥［16-18］。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究［16-19］表明：LM 對(duì)四環(huán)素、頭孢他啶、頭孢呋辛和頭孢曲松高度耐藥，與LM 細(xì)胞膜上PBP 相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。本研究分離得到的XY1803 菌株，在lmo1250（抗生素耐藥蛋白基因）存在25 個(gè)耐藥相關(guān)突變，變異度相對(duì)較小，故對(duì)頭孢類抗生素耐藥；但在lmo2355（多藥耐藥蛋白基因）、lmo1712（多藥耐藥蛋白基因）和lmo0839（四環(huán)素耐藥蛋白基因）存在較多突變，可以改變細(xì)菌耐藥蛋白的編碼，影響耐藥蛋白的結(jié)構(gòu)，故對(duì)四環(huán)素等其他抗生素耐藥性較低，與臨床藥敏實(shí)驗(yàn)和實(shí)際用藥結(jié)果相符合。

LM 感染最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)是腦膜腦炎（70%～97%），菱腦炎少見(jiàn)，大多數(shù)成人呈亞急性病程［20］。本例患者感染源于經(jīng)口攝入病菌（飲用過(guò)期牛奶），在不存在任何易感因素（妊娠、糖皮質(zhì)激素治療、免疫功能受損和年齡等）的情況下，迅速累及中腦和延髓導(dǎo)致呼吸衰竭和腦疝形成，呈現(xiàn)快速進(jìn)展的暴發(fā)性病程，臨床較為罕見(jiàn)。本文作者通過(guò)細(xì)菌基因組測(cè)序分析認(rèn)為：該菌株可能為新發(fā)LM，與以往人源性LM 同源性較低（小于88%），存在大量未知序列；細(xì)菌具有相對(duì)較強(qiáng)的感染性和侵襲性，并有超過(guò)300 個(gè)蛋白功能未知。該例患者即使在早期已使用足量、敏感的抗生素仍治療無(wú)效死亡，提示傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)只能粗略鑒定細(xì)菌種類和大致耐藥性，無(wú)法對(duì)菌株的基因組變異和耐藥性進(jìn)行全面分析。通過(guò)病原體高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)比對(duì)，可大大提高臨床醫(yī)師對(duì)感染細(xì)菌的全面了解，為感染性疾病的早期診斷和治療方案的制定提供客觀依據(jù)，同時(shí)加強(qiáng)了對(duì)臨床診療的預(yù)判性?？焖僭\斷和治療LM 疾病，引入一體化生物信息細(xì)菌基因組分析系統(tǒng)和基因組快速測(cè)序技術(shù)是未來(lái)臨床勢(shì)在必行的趨勢(shì)［9，21］，本研究為此類疾病的診斷、治療及耐藥性分析提供了重要的參考依據(jù)。