西紅花苷對(duì)大鼠缺血缺氧心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

黃建成, 郭世超, 劉璞娟, 董彥博, 李紅英,呂 瑛

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科，河北 石家莊 050031）

先天性心臟病是嬰幼兒最常見(jiàn)的先天性畸形，也是造成嬰幼兒死亡的主要病因，缺血缺氧是先天性心臟病患兒的病理生理過(guò)程，在缺血缺氧過(guò)程中，心肌細(xì)胞將產(chǎn)生一系列適應(yīng)性改變。心肌細(xì)胞凋亡是缺血缺氧心肌損傷的主要形式，其發(fā)生受多種基因表達(dá)的調(diào)控，其中B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，caspase-3） 與 細(xì) 胞 凋 亡 有 密 切 關(guān)聯(lián)［1-2］。西紅花苷（Crocin） 是西紅花的有效成分之一，具有降血壓、降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用［3-5］。近年來(lái)研究［6-7］表明：西紅花能夠減輕氧化損傷，改善微循環(huán)，對(duì)缺血缺氧心肌有一定保護(hù)作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)西紅花提取物西紅花苷對(duì)缺血缺氧心肌作用方面的相關(guān)研究。本研究建立缺血缺氧心肌損傷大鼠模型，采用不同劑量西紅花苷進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡情況，心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平以及血清中氧化相關(guān)損傷因子的變化，探討西紅花苷對(duì)缺血缺氧心肌損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為缺血缺氧心肌損傷的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)SD 大鼠50 只，雄性，4 周齡，體質(zhì)量（280±20）g，購(gòu)自于河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2015-0064。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食和飲水。BCA 蛋白試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，西紅花苷（純度98%） 購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司，兔抗鼠Bcl-2、兔抗鼠Bax、兔抗鼠caspase-3 和山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）、 乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH） 和 肌 酸 激 酶（creatine kinase，CK）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。PSM11R-090 型電子天平（德國(guó)梅特勒-托利多公司），YD-1508R 型石蠟切片機(jī)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司），蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司），9700 型PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立50 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量西紅花苷組、中劑量西紅花苷組和高劑量西紅花苷組，每組10 只。假手術(shù)組和模型組大鼠給予0.9%生理鹽水灌胃，低、中和高劑量西紅花苷組分別灌胃給予20、40 和80 mg·kg－1西紅花苷，每天1 次，連續(xù)5 d［8］。最后一次灌胃給藥結(jié)束后1 h，進(jìn)行模型建立。腹腔注射10%水合氯醛300 mg·kg－1將大鼠麻醉后，仰臥固定，于左胸3-4 肋間切皮，鈍性分離，暴露心臟，打開(kāi)心包，找到左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending，LAD），將無(wú)損傷縫合線于LAD 下穿過(guò)，完成打結(jié)。缺血成功標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見(jiàn)結(jié)扎線下心臟左室壁變暗變紫，心尖部變白，心電圖示心肌缺血，缺血30 min 后，剪斷結(jié)扎線，恢復(fù)心肌供血，恢復(fù)灌注120 min；再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：左心室和心尖部變紅潤(rùn)。待大鼠蘇醒后撤除呼吸插管，恢復(fù)自主呼吸，再灌注8 h 后取材。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎，其他操作相同。

1.3 HE 染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取大鼠心肌組織，液氮冷凍，采用10%的甲醛浸泡固定，沿左室長(zhǎng)軸的中點(diǎn)行組織切片，厚度為4 μ m，清洗，蘇木精染色5 min，清洗，置入含1% HCl 的無(wú)水乙醇中固定，用伊紅染色4 min，清洗，無(wú)水乙醇固定后石蠟包埋，置于光學(xué)顯微鏡下400 倍放大倍數(shù)觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取大鼠心臟，分離心尖部位心肌組織，采用4%多聚甲醛固定12 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，冰凍切片，厚度為4 μm，脫蠟至水，進(jìn)行TUNEL 染色，具體步驟：PBS 緩沖液洗滌3 次后，蛋白激酶K 工作液處理15 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入3% H2O2處理5 min 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入含0.1% Triton X-100 的0.1%枸櫞酸溶液去除細(xì)胞膜表面污物，PBS 緩沖液洗滌3 次。加入TUNEL 反應(yīng)液，于37 ℃避光孵育1 h，加DAPI，37℃避光孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，用抗熒光淬滅封片液，封片后置于熒光顯微鏡下觀察，TUNEL 顯示綠色熒光，DAPI 顯示藍(lán)色熒光。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，于400 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞AI，AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 RT-PCR 法檢測(cè)大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平取大鼠心尖部位心肌組織，采用異硫氰酸胍法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)260/280 nm 處檢測(cè)RNA 濃度，在甲醛-MOPS 凝膠電泳緩沖液中1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 質(zhì)量。反應(yīng)條件：25 ℃、10 min；42 ℃、60 min；85 ℃、5 min；終止反應(yīng)，冰浴5 min。Bax、Bcl-2 和caspase-3 引 物 均 根 據(jù) 標(biāo) 準(zhǔn)RT-PCR 引物設(shè)計(jì)原則，由上海瑞晶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列：Bcl-2，上游引物5′-GTGAACTGGGGGAGGAT-TGT-3′，下 游 引 物5′-GCATCCCAGCCTCCG-TTA-3′，167 bp；Bax，上 游 引 物 5′-CCCGAGAGGTCTTCTTCCG-3′，下 游 引 物5′-GAAGTCCAGTGTCCAGCC CA-3′，167 bp； caspase-3，上 游 引 物5′-CGAAACTCTTCATCATTCAGGC-3′ ，下游引物5′-AGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-3′，129 bp；β-actin，上 游 引 物5′-CCCATCTATGAG-GGTTACGC-3′，下 游 引 物5′-TTTAATGTCA-CGCACGATTTC-3′，150 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃、 4 min；94 ℃、20 s，60 ℃、 30 s，72 ℃、30 s ，循環(huán)35 次；72 ℃檢測(cè)信號(hào)。以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平取大鼠心尖部位心肌組織，制成勻漿，離心，收集上層蛋白質(zhì)抽提物，采用BCA 蛋白試劑盒定量。組織蛋白用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜。采用5%無(wú)脂牛奶封閉1 h，TTBS 緩沖液處理5 min，轉(zhuǎn)膜，分別加入Bcl-2（1∶500）、Bax （1∶500） 和 活 化 型caspase-3（1∶500） 一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000），37 ℃孵育45 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，定量分析。內(nèi)參抗體為β-actin。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性造模8 h 后，大鼠斷頭取血，靜置15 min后，3 000 r·min－1離心分離血清，采用試劑盒測(cè)定MDA 水平及SOD、LDH 和CK 活性，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠心肌細(xì)胞AI，心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，血清中MDA 水平及SOD、LDH 和CK 活性，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠心肌纖維紊亂、出現(xiàn)水腫，心肌間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，低劑量西紅花苷組大鼠心肌炎細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維水腫程度減輕；中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌纖維無(wú)明顯水腫，心肌細(xì)胞胞核大小均勻，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌肌纖維破壞減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of myocardium tissue of rats in various group(HE，×400)

2.2 各組大鼠心肌AI與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌AI 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌AI 明顯降低（P＜0.05）；與低劑量西紅花苷組比較，中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌AI 明顯降低（P＜0.05）；與中劑量西紅花苷組比較，高劑量西紅花苷組大鼠心肌AI 明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表1。

表1 各組大鼠心肌AITab.1 AI of myocardium of rats in various groups

2.3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3mRNA表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量西紅花苷組比較，中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量西紅花苷組比較，高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 mRNA表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of Bcl-2, Bax and caspase-3 mRNA in myocardium tissue of rats in various groups

2.4 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量西紅花苷組比較，中和高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量西紅花苷組比較，高劑量西紅花苷組大鼠心肌組織Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3 和圖3。

表3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

圖3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中SOD 活 性 明 顯 降 低（P＜0.05），MDA 水 平 和LDH 及CK 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量西紅花苷組大鼠血清中SOD 活 性 明 顯 升 高（P＜0.05），MDA 水 平 和LDH 及CK 活性明顯降低（P＜0.05）；各劑量西紅花苷組大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及和CK 活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性Tab.4 Levels of MDA and activities of SOD, LDH and CK in serum of rats in various groups (n=10,)

表4 各組大鼠血清中MDA 水平和SOD、LDH 及CK 活性Tab.4 Levels of MDA and activities of SOD, LDH and CK in serum of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Sham operation Model Crocin Low dose Medium dose High dose MDA[cB/(mol·L－1)]5.98±0.83 16.27±1.84*SOD[λB/(U·mL－1)]48.51±6.21 26.20±5.31*LDH[λB/(U·L－1)]2 576±278 3 546±330*CK[λB/(U·mL－1)]0.52±0.07 1.37±0.18*1.08±0.20△0.95±0.15△0.86±0.14△10.42±1.13△9.20±1.62△7.84±1.31△36.62±3.47△38.49±2.99△42.37±4.03△2 927±213△2 710±227△2 697±194△

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)急性心肌梗死的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，具有發(fā)病迅速和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人們健康［9］。本研究通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支再灌注的方法建立大鼠缺血缺氧心肌損傷模型，具有操作簡(jiǎn)便、成功率高的特點(diǎn)。本研究中HE 染色結(jié)果表明：模型組大鼠心肌纖維紊亂、出現(xiàn)水腫，心肌間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與相關(guān)研究［10］結(jié)果基本一致，說(shuō)明采用該方法建立大鼠缺血缺氧心肌損傷模型可靠。研究［11-12］表明：心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷均是缺血缺氧心肌損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。激活型caspase-3 在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的作用下，大范圍水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)及后續(xù)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［13］。Bcl-2 能夠通過(guò)抑制caspase-3 激活，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用［14］。Bax 主要通過(guò)破壞線粒體滲透 性，并 激 活caspase-3 促 進(jìn) 細(xì) 胞 凋 亡［15］。Bax 與Bcl-2 聚合成二聚體相互抑制活性，因此Bcl-2 與Bax 比值能反映出二者對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用［16］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌AI 明顯升高，心肌組織中Bcl-2 表達(dá)水平降低，Bax 和caspase-3 表達(dá)水平升高，與譚亞芳等［17］研究結(jié)果一致，說(shuō)明心肌缺血缺氧通過(guò)降低Bcl-2 表達(dá)，提高Bax 和caspase-3 表達(dá)，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞損傷后，細(xì)胞膜通透性增加，心肌細(xì)胞內(nèi)心肌酶LDH 和CK 釋放入血，血清中LDH 和CK 活性可反映心肌壞死量，判斷心肌細(xì)胞損傷程度［18］。SOD 是 清 除 自 由 基 的 首 要 物 質(zhì)，MDA 作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，二者通常作為機(jī)體清除氧自由基能力和機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)［19-20］。本研究結(jié)果表明：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LDH 和CK 活性升高，SOD 活性降低，MDA水平升高，與高維明等［21］研究結(jié)果一致，說(shuō)明大鼠心肌缺血缺氧損傷嚴(yán)重，機(jī)體清除氧自由基能力下降，機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度加重。

西紅花苷是藥材西紅花的主要成分，研究［22］表明：西紅花苷具有顯著的心血管保護(hù)作用和抗氧化活性。本研究結(jié)果表明：低、中和高劑量西紅花苷干預(yù)后，大鼠心肌AI 降低，心肌組織中Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，Bax 和caspase-3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低，血清中MDA 水平降低，SOD 活性升高，LDH 和CK 活性降低，與楚溪等［23］研究報(bào)道一致，說(shuō)明西紅花苷能夠有效抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌過(guò)氧化程度。

綜上所述，西紅花苷能通過(guò)上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，下調(diào)Bax 和caspase-3 表達(dá)，抑制再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解心肌組織氧化應(yīng)激損傷。