氯化鋰對Aβ1-42引起的星形膠質細胞谷氨酸釋放的抑制作用及其對海馬神經元損傷的保護作用

劉 琪, 張顯晨, 李香雨, 林鈺淼, 楊顏齊, 閆恩志

（錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，遼寧 錦州121001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）越近晚期療效越差，研究［1-3］表明：抑制谷氨酸的興奮性損傷，在AD 早期的防治中具有重要意義，但目前尚缺乏有效的治療藥物及作用靶點。在腦組織中，星形膠質細胞（astrocytes，AS）是谷氨酸代謝的關鍵場所，不僅參與谷氨酸的代謝循環(huán)，還對細胞外高濃度谷氨酸具有緩沖調節(jié)作用［4］。近年來 的 研 究［5］證 實： β 淀 粉 樣 蛋 白（β-amyloid protein，Aβ）可激活AS 釋放谷氨酸，引起神經元損傷以及突觸結構和功能的改變。長期以來鋰鹽是治療雙相障礙（躁狂抑郁癥）的有效藥物。臨床研究［6-7］顯示：鋰可降低雙相障礙患者晚期并發(fā)AD的概率；臨床和動物實驗［8-10］證明：長期使用小劑量鋰制劑，可延緩AD 患者認知功能障礙的進展；最近的研究［11-12］顯示：鋰鹽可對抗急性刺激所致AS 的老化損傷，而AS 的老化可促進谷氨酸對神經元的興奮性損傷，表明鋰可能在AD 早期具有預防和治療作用，但其機制目前還不清楚。本研究前期實驗［13-14］證實：氯化鋰可抑制細胞膜去極化所致AS 內質網上三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和雷尼?。≧yanodine）敏感性內Ca2+儲池及谷氨酸的釋放，但該作用是否對Aβ 引起的AS 谷氨酸的釋放具有抑制作用尚未見研究報道。本研究通過離體培養(yǎng)AS 和海馬神經元的方法，探討氯化鋰的對β 淀粉樣蛋白1-42（β-amyloid protein 1-42，Aβ1-42）所致神經元損傷的保護作用，并闡明其機制，為AD 的治療及新藥的開發(fā)提供依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑氯化鋰、谷氨酸、L-多聚賴氨酸、二甲基亞砜（DMSO）、二丁酰環(huán)腺苷酸（dBcAMP）、硝苯地平（Nifedipine）、毒胡蘿卜素（Thapsigargin） 和Aβ1-42購 于 美 國Sigma 公 司，Ryanodine和鈉-鈣交換蛋白1（Na+-Ca2+exchanger 1，NCX1） 抑 制 劑KB-R7943 購 于 美 國Calbiochem 公司，F(xiàn)ura-2 AM 和DMEM 培養(yǎng)基購于美國Invitrogen 公司，馬血清購于廣州蕊特生物科技有限公司，瞬時受體電位通道蛋白1 （transient receptor potential channel 1，TRPC1）、NCX1、電壓門控鈣離子通道蛋白（CACNA1C，Cav1.2）一抗和山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz 公司，β-肌動蛋白（β-actin）購于上海碧云天試劑公司，一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒購于北京邦定生物工程公司，SuperSignal West Pico 化學發(fā)光底物購于美國Thermo scientific 公司。

1.2 AS 培養(yǎng)AS 培養(yǎng)參見本課題組前期采用的方法［13-14］，取出生1 d 的CD-1 小鼠大腦皮層。剝離腦膜后，將腦組織切碎，震蕩1 min，用100 μm 和70 μm 濾膜過濾，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中用于谷氨酸釋放實驗檢測，或將細胞懸液接種于經過多聚賴氨酸處理的蓋玻片上用于鈣離子水平檢測。培養(yǎng)基為含10 %馬血清的DMEM。培養(yǎng)3 周后用于實驗，加入0.25 mmol·L－1dBcAMP 促進AS 分化成熟。

1.3 海馬神經元培養(yǎng)及分組取出生24 h 內的小鼠乳鼠，75%酒精浸泡乳鼠消毒1 min，斷頭，置于無菌DMEM 培養(yǎng)基內，無菌條件，剝離大腦，取出海馬組織，置于DMEM/F12 培養(yǎng)基中，剪成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化10 min。細胞分散后，加入少量10%胎牛血清終止消化。200 目篩網過濾，1 000 g 離心10 min，細胞懸液由含有10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基制成，調整細胞密度為1×105L－1～1×107L－1，接種在鋪有L-多聚賴氨酸培養(yǎng)皿或6 孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后加入含阿糖胞苷（終濃度為5 mg·L－1） 的培養(yǎng)基，抑制非神經元增殖。以后每3 d 半量換液1 次，7 d 后用于實驗。海馬神經元成熟化后，分為3 組：①對照組，不進行處理；②Aβ1-42組，AS 培養(yǎng)體系內加入250 nmol·L－1Aβ1-42作用48 h，將Aβ1-42處理后的AS 條件培養(yǎng)基（ACM）加入海馬神經元中作用24 h；③Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組，向預先加入0.25、0.50 和1.00 mmol·L－1氯 化 鋰 處 理 后 的ACM 中 加 入250 nmol·L－1Aβ1-42作用48 h，將處理后的ACM加入培養(yǎng)的海馬神經元中作用24 h。各組以Aβ1-42處理48 h 的不含AS 的條件培養(yǎng)基為對照。

1.4 熒光探針技術檢測AS中Ca2+水平蓋玻片上進行原代AS 培養(yǎng)，AS 分為對照組、 Aβ1-42+不同劑量（0.25、0.50 和1.00 mmol·L－1） 氯化鋰組和 阻 斷 劑 組 （Nifedipine 組、KB-R7943 組 和Ryanodine 組），Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組加入不同劑量氯化鋰作用2 周。AS 在37oC 培養(yǎng)箱中，加入含F(xiàn)ura-2 AM（5 μmol·L－1）的等滲液進行熒光負載30 min，反復沖洗細胞2 次，去除沒有進入細胞熒光染 料。等 滲 液（mmol·L－1）：137 NaCl，5 KCl，0.44 KH2PO4，4 NaHCO3，1.3 CaCl2，0.8 MgSO4，0.5 MgCl2·6H2O，10 Glucose。將細胞置于熒光顯微鏡下，調整參數(shù)為20 s 測定一個間隔循環(huán)。每孔加入等滲液180 μL，待曲線平穩(wěn)后，加入終濃度為250 nmol·L－1Aβ1-42刺激細胞，各阻斷劑組在加入Aβ1-42前，分別向細胞中加入100 nmol·L－1Nifedipine、10 μmol·L－1KB-R7943 和1 μmol·L－1Ryanodine 各20 μL 作用10 min。在激發(fā)波長分別為340 和380 nm、發(fā)射波長為510 nm 條件下，進行雙波長細胞中Ca2+水平測定。實驗測定60 個循環(huán)。 Ca2+再充功能實驗中，AS 分為對照組和Aβ1-42+0.50 mmol·L－1氯化鋰組，按上述方法熒光負載后，每孔加入180 μL 無Ca2+等滲液，置于熒光顯微鏡下，待曲線平穩(wěn)后，向細胞中加入20 μL終濃度為1 μmol·L－1的Thapsigargin 作用10 min 后，再加入終濃度為2 mmol·L－1的CaCl2，測定40 個循環(huán)。熒光檢測結果以波長340 和380 nm 熒光的比值（F340/F380）表示。

1.5 谷氨酸釋放實驗AS 分為對照組、Aβ1-42組和Aβ1-42+不同劑量（0.25、0.50和1.00 mmol·L－1）氯化鋰組，氯化鋰組加入不同劑量氯化鋰作用2 周后，去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入緩沖液清洗30 min，去除緩沖液，置于臺面上傾斜15°，用蠕動 泵 以0.5 mL·min－1流 速 加 入250 nmol·L－1的Aβ1-42刺激細胞，收集細胞上清液，取400 μL 上清液加入200 μL 鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA） 溶 液 衍 生3 min，進 行 高 效 液 相 色 譜（HPLC）程序，計算谷氨酸釋放量，用1 mol·L－1的氫氧化鈉收集細胞，進行蛋白測定，將測定值代入標準曲線公式，計算出每分鐘、每毫克細胞釋放的谷氨酸量。

1.6Western blotting 法檢測AS 中鈣離子通道蛋白表達水平AS 分為對照組和Aβ1-42+不同劑量（0.25、0.50 和1.00 mmol·L－1） 氯化鋰組，處理方法見“1.5”，將培養(yǎng)皿中AS 置于冰盒上，加入裂解液后收集細胞，進行蛋白定量，蛋白濃度調成一致后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離的蛋白經過轉膜后封閉，加入一抗后4℃過夜，二抗孵育2 h（1∶1 000 稀釋），進行ECL 化學發(fā)光，圖像采集，實驗重復3 次后采用Visionworks 6.3.3 分析軟件對蛋白條帶進行分析，以TRPC1、NCX1 和Cav1.2 蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值之比表示目的蛋白表達水平。

1.7 海馬神經元樹突形態(tài)學觀察體外培養(yǎng)海馬神經元分組及處理見“1.3”。采用配備CCD 和Tsview 軟件的Olympus CKX41SF 型倒置相差顯微鏡，通過10 倍或20 倍物鏡觀察，確保讓一個神經元拍攝在一個視野中，通過40 倍物鏡觀察樹突分支，以保證能夠清楚展現(xiàn)全部樹突分支。分析時采用Ohara 和Havton 命名法：從胞體直接伸出的樹突分支為一級分支，從一級分支伸出的為二級分支，依次類推。用SPOT 軟件測量隨機選取的海馬神經元，測量樹突分支總長度（total dendrite branch length，TDBL）、 神 經 元 一 級 樹 突 分 支 數(shù)（primary-order dendrite number，PDN） 和神經元樹突總分支數(shù)（maximum branch order，MAO）。計數(shù)樣本從3 個不同批次培養(yǎng)的神經元獲取，每批次隨機選擇10～15 個細胞，采用雙盲方法。

1.8 Griess 法檢測海馬神經元培養(yǎng)液中NO 釋放量海馬神經元分組及處理見“1.3”。用1 mol·L－1亞硝酸鈉溶液配制標準品（0、1、2、5、10、20、40、60 和100 μmol·L－1）。按50 μL/孔在96 孔細胞培養(yǎng)板中加入標準品和樣品。按50 μL/孔，在每個孔中分別加入室溫Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ。在波長540 nm處檢測吸光度（A）值。將亞硝酸鈉濃度（μ mol·L－1） 作為橫坐標，測得A 值作為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數(shù)，吸取各組培養(yǎng)海馬神經元的培養(yǎng)上清液，測定NO 釋放量。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗結果來自于單獨培養(yǎng)的3 個批次的細胞，各組細胞中Ca2+水平，谷氨酸釋放量，細胞中TRPC1、NCX1 和Cav1.2 蛋白表達水平，海馬神經元TDBL、PDN 和MBO，海馬神經元NO 釋放量，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD 法。以α=0.05 為檢驗水準。

2 結 果

2.1 加入不同阻滯劑后各組AS中Ca2+水平培養(yǎng)于蓋玻片上成熟的AS 用Fura-2 AM 處理后進行細胞內Ca2+測定，F(xiàn)ura-2 AM 可穿透細胞膜進入細胞內與Ca2+結合，結合Ca2+后在340 nm 激發(fā)光下可以產生較強的熒光（綠色），而在380 nm 激發(fā)光下則會導致熒光減弱，以F340/F380 表示細胞中Ca2+水平（圖1）。采用250 nmol·L－1Aβ1-42刺激，能持久引起AS 中Ca2+水平升高，分別應用L-channel 鈣通道抑制劑Nifedipine、Na+-Ca2+抑制劑KB-R7943 和Ryanodine 受體抑制劑Ryanodine后，細胞中Ca2+水平升高均被抑制，而Na+-Ca2+抑制劑KB-R7943 并不能阻斷細胞中Ca2+水平升高（圖2）。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組AS 中Ca2+水平(×200)Fig.1 Levels of Ca2+in AS in various groups observed under fluorescence microscope(×200)

圖2 熒光探針技術檢測各組AS 中Ca2+水平Fig.2 Levels of Ca2+ in AS in various groups detected by fluorescence probe technique

2.2 加入不同劑量氯化鋰后各組AS 中Ca2+水平取Aβ1-42刺激后3、5、7 和9 min 時間點數(shù)據進行分析（圖3），與對照組比較，Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組AS 中Ca2+水平明顯降低（P＜0.05），Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組AS 的Ca2+再充功能Thapsigargin 是細胞內質網上Ca2+-ATP 酶的抑制劑，可耗竭AS 內儲存的Ca2+。AS 加入Thapsigargin 作用10 min，充分耗竭細胞內儲存的Ca2+，在重新加入終濃度2 mmol·L－1CaCl2后，觀察Ca2+再充功能（圖4）。以加入CaCl2后的2 min 內的F340/F380 值（代表Ca2+再充水平） 進行分析：與對照組（1.95±0.01） 比 較，Aβ1-42+0.50 mmol·L－1氯 化 鋰 組F340/F380 值 （1.47±0.02） 明 顯 降 低 （P＜0.01），表明氯化鋰作用2 周能明顯抑制AS 內Ca2+再充功能。

2.4 各組AS 谷氨酸釋放量HPLC 結果顯示：與對照組比較，Aβ1-42組谷氨酸釋放量明顯增加（P＜0.01）；與Aβ1-42組比較，Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組AS 的谷氨酸釋放量明顯降低（P＜0.01），Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.5 各組AS 中鈣離子通道蛋白表達水平與對照組比較，Aβ1-42+ 不同劑量氯化鋰組AS 中TRPC1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），NCX1 和CAV1.2 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5 和表2。

圖3 加入氯化鋰后各組AS 中Ca2+水平Fig.3 Levels of Ca2+ in AS in various groups after added with lithium chloride

2.6 各組海馬神經元樹突形態(tài)表現(xiàn)培養(yǎng)7 d 的海馬神經元加入Aβ1-42刺激的ACM 作用24 h 后，Aβ1-42組海馬神經元突起的生長發(fā)育被明顯抑制（圖6）。與對照組比較，Aβ1-42組海馬神經元TDBL、PDN 和MBO 明顯減少（P＜0.01）； 與Aβ1-42組比較，Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組海馬神經元TDBL、PDN 和MBO 明 顯 增 加（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

2.7 各組海馬神經元NO 釋放量與對照組比較，加入Aβ1-42處理的ACM 24 h 后，Aβ1-42組海馬神經元NO 釋放量明顯增加（P＜0.01）；與Aβ1-42組比較，Aβ1-42+不同劑量氯化鋰組海馬神經元NO 釋放量明顯減少（P＜0.05）。加入Aβ1-42處理的不含AS的培養(yǎng)基24 h 后，各組海馬神經元NO 釋放量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

3 討 論

圖4 熒光探針技術檢測AS 的Ca2+再充功能Fig.4 Ca2+ influx of AS detected by fluorescence probe technique

表1 各組AS 谷氨酸釋放量Tab. 1 Amounts of glutamate release in AS in various groups

表1 各組AS 谷氨酸釋放量Tab. 1 Amounts of glutamate release in AS in various groups

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with Aβ1-42 group.

Group Control Aβ1-42 Aβ1-42+0.25 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+0.50 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+1.00 mmol·L－1 lithium chloride Amount of glutamate release 2.08±0.24 9.46±1.39*5.29±1.03△4.69±0.78△4.14±0.83△

Aβ 沉積和細胞內神經纖維纏結是AD 典型的病理改變，然而近年來圍繞抑制或清除Aβ 所研發(fā)的藥物均告失?。?5］，提示AD 早期可溶性Aβ 引發(fā)的炎癥反應或興奮性損傷，可能是導致神經元突觸結 構 和 功 能 改 變 的 主 要 原 因［2，15］。研 究［16］證 實：AD 患者腦脊液中谷氨酸表達水平異常升高，但其具體機制尚不清楚。AS 是腦內谷氨酸代謝的關鍵場所［4］，本研究通過離體實驗證明：Aβ 可促進AS釋放谷氨酸，與近年來發(fā)現(xiàn)的Aβ 與谷氨酸興奮性損傷相關的報道［1，17-18］一致。鋰鹽對AD 患者海馬神經元具有保護作用，臨床隨機雙盲試驗［19］顯示：長期服用小劑量鋰可延緩AD 患者認知功能障礙 的 進 展。最 近 的 研 究［11，20］表 明：AS 是 鋰 鹽 的主要作用靶點。本研究首次證明了氯化鋰對Aβ 引起的AS 谷氨酸釋放具有抑制作用。有研究［5，18］表明：細胞外過多的谷氨酸引起突觸外N-甲基-D-天冬氨 酸（N-nethyl-D-aspartic acid，NMDA） 受體（extrasynaptic NMDA receptors，eNMDAR）的活化是AD 最早期的病理改變，也是引起突觸損傷的主要因素。因此，本研究結果為鋰鹽在AD 早期治療的作用提供了理論依據。

圖5 Western blotting 法檢測各組AS 中TRPC1(A)、NCX1(B)和Cav1.2(C)蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of TRPC1(A)，NCX1(B) and Cav1.2(C) proteins in AS in various groups detected by Western blotting method

表2 各組AS 中TRPC1、NCX1 和Cav1.2 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of TRPC1,NCX1，and Cav1.2 proteins in AS in various groups (n=3,)

表2 各組AS 中TRPC1、NCX1 和Cav1.2 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of TRPC1,NCX1，and Cav1.2 proteins in AS in various groups (n=3,)

*P＜0.05 compared with control group.

Group Control Aβ1-42+0.25 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+0.50 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+1.00 mmol·L－1 lithium chloride Cav1.2 0.377±0.016 0.336±0.018 0.353±0.015 0.323±0.017 TRPC1 0.795±0.017 0.521±0.025*0.427±0.027*0.326±0.024*NCX1 0.831±0.024 0.806±0.033 0.836±0.029 0.826±0.028

圖6 倒置相差顯微鏡下觀察各組海馬神經元樹突形態(tài)表現(xiàn)(×400)Fig.6 Morphology of dendrite of hippocampal neurons in various groups observed under inverted phase-contrast microscope(×400)

表3 各組海馬神經元TDBL、PDN 和MBOTab.3 TDBL,PDN and MBO in hippocampal neurons in various groups (n=25,)

表3 各組海馬神經元TDBL、PDN 和MBOTab.3 TDBL,PDN and MBO in hippocampal neurons in various groups (n=25,)

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with Aβ1-42 group.

Group Control Aβ1-42 Aβ1-42+0.25 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+0.50 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+1.00 mmol·L－1 lithium chloride MBO 3.56±0.72 2.28±0.42*2.86±0.55△△3.06±0.65△△3.17±0.58△△TDBL(l/μm)425±24 279±18*319±23△328±22△△332±22△△PDN 2.45±0.27 1.19±0.21*1.68±0.22△1.71±0.24△△1.74±0.22△△

表4 各組海馬神經元NO 釋放量Tab. 4 Amounts of NO release in hippocampal neurons in various groups

表4 各組海馬神經元NO 釋放量Tab. 4 Amounts of NO release in hippocampal neurons in various groups

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with Aβ1-42 group.

NO Group ACM Control Aβ1-42 Aβ1-42+0.25 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+0.50 mmol·L－1 lithium chloride Aβ1-42+1.00 mmol·L－1 lithium chloride 5.79±0.49 8.83±0.77*7.82±0.75△7.80±0.74△7.72±0.72△Culture medium 5.23±0.33 5.57±0.46 5.49±0.51 5.67±0.48 5.44±0.44

AS 在腦內的活性與細胞內Ca2+濃度有關聯(lián)，研究［5，21］表明：Aβ 引起AS 谷氨酸釋放具有Ca2+依賴性。本研究證實：Aβ1-42引起谷氨酸釋放的同時，也導致AS 中Ca2+水平持久性升高，氯化鋰在抑制Aβ1-42所致谷氨酸釋放的同時，也抑制了細胞中Ca2+水平的升高。在AS 細胞膜上，Ca2+可通過Na+-Ca2+交換、電壓依賴性Ca2+通道和鈣池操縱性Ca2+離 子 通 道（store operated calcium channels，SOCE） 進 入 細 胞。 在AS 內 質 網 中 有IP3和Ryanodine 敏感性內Ca2+儲池釋放。雖然研究［22-23］表明：細胞外Ca2+內流可引起谷氨酸釋放，但在應用IP3 受體和Ryanodine 受體2 種功能性Ca2+儲池的拮抗劑2APB 和Ryanodine 后，谷氨酸釋放可明顯被抑制，表明細胞內Ca2+儲池釋放，是導致谷氨酸釋放的主要原因，細胞外Ca2+內流只是引起短暫的細胞內Ca2+增加。瞬時受體電位通道蛋白（transient receptor potential channel，TRPC） 是SOCE 的主要組成蛋白，內質網Ca2+儲池釋放后可激活胞漿膜上TRPC 通道蛋白，補充胞內Ca2+，在AS 胞 漿 膜 上 主 要 表 達TRPC1 、 TRPC4 和TRPC5 3 種亞型。研究［24-25］表明：TRPC1 在谷氨酸釋放過程中起著重要作用，用TRPC1 抗體孵育細胞后，細胞內Ca2+濃度以及谷氨酸的釋放均被抑制。 本研究中應用Ca2+-ATP 酶抑制劑Thapsigargin 耗竭細胞內儲存Ca2+后，在細胞外重新加入2 mmol ·L－1CaCl2，也僅能部分引起細胞內Ca2+的增加。同時本研究對細胞膜上Ca2+通道蛋白測定結果表明：氯化鋰對細胞內Ca2+的穩(wěn)定調節(jié)作用與其下調TRPC1 表達有關，而與細胞膜上Na+-Ca2+交換和電壓依賴性鈣通道無關，初步證明鋰鹽對AS 內Ca2+濃度的抑制作用及機制。

Aβ 可促進AS Ca2+依賴的谷氨酸釋放，突觸間隙谷氨酸持續(xù)升高可激活神經元eNMDAR，可進一步導致神經元NO 的產生、tau 蛋白的磷酸化、caspase-3 的激活及NO 的生成被認為是導致神經元興奮性損傷的最主要因素，NO 可引起神經元線粒體裂解、 突觸損傷，進而引發(fā)認知功能下降［5，26-27］。本研究結果表明：海馬神經元在加入ACM 后NO 釋放量明顯增加，同時神經元發(fā)生損傷性改變，而加入氯化鋰作用后的ACM，海馬神經元NO 釋放量減少，同時神經元損傷程度減輕，但與對照組比較，氯化鋰并不能完全逆轉神經元的損傷性改變，說明Aβ 所致谷氨酸釋放只是其導致神經元損傷的機制之一。

本研究從離體水平上證明了氯化鋰抑制谷氨酸釋放在神經元保護中的作用，為其在AD 治療中的應用提供了一定的理論依據，但Aβ 可通過多途徑損傷神經元，而腦內谷氨酸在海馬神經元和AS 之間的調節(jié)及信息傳遞也是一個復雜過程，因此氯化鋰如何調控TRPC1 蛋白表達，且其調控作用在AD 動物模型中是否仍然具有保護作用還需進一步研究證實。