珍稀瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細菌多樣性研究

周 強，孫冬偉，李海燕，岳 杰，陳旭輝，曲 波，張麗杰

(1.遼寧省林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，沈陽110031；2.撫順市林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 撫順113006；3.遼寧老禿頂子國家級自然保護區(qū)撫順管理站，遼寧 撫順113208；4.沈陽市東陵公園管理中心， 沈陽110161；5.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)a.生物技術(shù)學(xué)院，b.林學(xué)院/遼寧省林木遺傳育種與培育重點實驗室， 沈陽110161)

蘭科植物是被子植物分布最廣范的科之一，全世界大約有736 屬28000 種蘭科植物，廣泛分布于大部分陸地生態(tài)系統(tǒng)中[1-2]。我國野生蘭科植物最為豐富，具有從原始蘭科到高級蘭科的一系列進化群以及復(fù)雜多樣的地理分布類型[3]。蘭科植物在系統(tǒng)演化上作為一類比較特殊的類群，已成為生物學(xué)的研究熱點[4]。據(jù)現(xiàn)有資料表明，蘭科植物多為珍稀瀕危植物，全世界所有野生蘭科植物均已列為《野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約》（CITES）的保護范圍，蘭科植物的保護也日趨受到國內(nèi)外研究者的高度重視[5-7]。

雙蕊蘭（Diplandrorchis sinica）是蘭科（Orchidaceae）雙蕊蘭屬（Dipladrorchis）腐生小草本，為我國特有的單種屬孓遺物種[8]，是國家二級保護珍稀瀕危植物[9]。 陳心啟[8]提出雙蕊蘭屬是一個極其原始和在系統(tǒng)發(fā)育上有重要意義的蘭科新屬。 何毅等[10]于2012 年和2013 年連續(xù)兩年在秦嶺和黃土高原對植被資源進行調(diào)查，首次發(fā)現(xiàn)該地區(qū)有雙蕊蘭變異種出現(xiàn)，豐富了對該珍稀瀕危物種的認識。雙蕊蘭因其具有兩枚生于蕊柱頂端腹背方向的能育雄蕊而得名。 植株具13～17 朵淡綠色或綠白色花；花瓣與唇瓣相似，花藥寬卵狀長圓形，柱頭頂生，蕊喙不存在，其花被近輻射對稱；花近直立幾不扭轉(zhuǎn)、柱頭直立且無蕊喙等特征表明其應(yīng)屬于蘭科鳥巢蘭族中最為原始的類群之一[11]。 雙蕊蘭營腐生生活，對生長環(huán)境要求非常高，且生活周期短，僅20 余天[12-13]。 雙蕊蘭的分布區(qū)域極其狹窄，繁殖方式及傳粉方式至今未知，極大地限制了雙蕊蘭的種群數(shù)量。 至今，雙蕊蘭瀕危機制尚不清楚。 稀有和瀕危植物的遺傳學(xué)研究是國內(nèi)外學(xué)者研究和討論的熱點[14]。 對稀有或瀕危物種遺傳多樣性進行研究，有助于深層次了解物種進化歷史及致瀕機制，便于采取有效的科學(xué)措施進一步保護瀕危物種，這也是保護生物學(xué)研究的核心[14-15]。物種遺傳變異高低不僅僅與類群的分布范圍有關(guān)而且也與類群的起源、進化歷史、生殖特點、生物學(xué)特性以及環(huán)境條件等諸多因素有關(guān)[14-15]。因此，珍稀瀕危植物致瀕機制的研究就需要建立在對其物種本身遺傳多樣性和土壤生境微生物多樣性充分了解的基礎(chǔ)上，對珍稀瀕危物種不僅要保護其種群數(shù)量，更要保護其遺傳多樣性和微生物多樣性及進化潛力，這樣才能有助于揭示物種瀕危的內(nèi)在機制。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者，在改良土壤質(zhì)量、促進養(yǎng)分循環(huán)過程中具有重要的作用[16]。 這些微生物中細菌作為主要組成菌種，以其對環(huán)境變化的敏感性和活躍性成為一個重要指示指標(biāo)[17]。 土壤根際是一個特殊的生態(tài)系統(tǒng)，根際土壤易受植物根系的影響，是有益和有害微生物與宿主植物之間發(fā)生復(fù)雜相互作用的一個微小區(qū)域，在這個微小區(qū)域中蘊含著及其豐富的微生物資源[18]。 在這些微生物資源中，細菌則是根際土壤中數(shù)量最為豐富、種類最多的微生物類群，有些種類的細菌可以促進植物的生長發(fā)育，而有害微生物亦可抑制植物的正常生長發(fā)育[19-20]。近年來，很多學(xué)者運用微生物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)和Miseq 測序技術(shù)等分子生物學(xué)手段探索土壤微生物和植物生長之間的互作關(guān)系[19]。 因此，為探明環(huán)境中土壤細菌與雙蕊蘭生長的相互關(guān)系，以雙蕊蘭根際土壤為研究對象，基于Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)對瀕危雙蕊蘭根際土壤細菌16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)片段進行測序，擬從分子水平揭示雙蕊蘭根際土壤細菌群落多樣性，以期為有效保護雙蕊蘭瀕危植物資源提供科學(xué)借鑒和參考，并為進一步探討雙蕊蘭的人工繁殖、仿生境栽培及瀕危機制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品于2016 年8 月10 日采自遼寧省老禿頂子自然保護區(qū)撫順管理局鴻雁護林防火站（124°41′13″～125°5′15″E，41°11′11″～41°21′34″N），在海拔500～632m 雙蕊蘭保護區(qū)內(nèi)選取生長的3 株雙蕊蘭，以雙蕊蘭植株生長點為中心，取0～20cm 深度的土壤作為根區(qū)土壤。 根際土壤采用抖落法[21]，先抖落根系上附著的大塊土壤，然后輕輕抖落根系或用小鑷子輕觸附著在肉質(zhì)根上的0～4mm 的土壤，收集起來為根際土。 將根際土裝入無菌封口塑料袋中，置于冰盒中，帶回實驗室后立即將土壤樣品進行混合，混勻后過篩去除雜質(zhì)，均分為4 等份，分別標(biāo)記為T1，T2，T3，T4。 樣品置于-80℃冰箱內(nèi)保存，供土壤微生物指標(biāo)分析使用。

1.2 根際土壤基因組DNA 提取

使用MO BIO Power 土壤DNA 提取試劑盒提取根際土壤總DNA。 具體方法按照試劑盒說明書操作。 然后使用NanoDrop 分光光度計檢查DNA 濃度和質(zhì)量。 DNA 樣品保存于-40°C 冰箱供后續(xù)試驗使用。

1.3 PCR 擴增

以提取的雙蕊蘭根際土壤基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增。 細菌16S rRNA 采用F515：5"-GTGCCAG CMGCCGCGG-3′和R909：5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′作為通用引物， 使用Miseq 測序儀擴增16S rRNA 基因的V4 高變區(qū)，進行焦磷酸測序[22-23]。 PCR 混合物反應(yīng)體系為25μL，包含1x PCR 緩沖液，1.5mM Mg-Cl2，0.4μM 脫氧核苷三磷酸，1.0μM 引物，0.5U ExTaq（TaKaRa）和土壤基因組DNA10ng。 PCR 擴增程序包括初始變性。94℃3min，然后進行94℃40s，56℃60s 和72℃60s 30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min。對每個樣品進行兩次PCR 反應(yīng)， 使用1.0%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進行電泳。 使用DNA 凝膠提取試劑盒 （Sangon Biotech SK8132） 回收并純化條帶， 定量后將所有樣品以等摩爾量混合制備測序樣品。 應(yīng)用于Illumina Miseq 系統(tǒng)Reagent Kit v22×250bp 進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

通過高通量測序技術(shù)獲得原始數(shù)據(jù)，借助于生物信息學(xué)軟件進行序列拼接、過濾，最后獲得高質(zhì)量的Taqs 序列。 基于97%閾值對高質(zhì)量序列進行分類單元聚類分析，并采用Mothur 軟件對細菌群落多樣性指數(shù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀕危雙蕊蘭根際土壤總DNA 提取

使用MO BIO Power 土壤DNA 提取試劑盒提取根際土壤總DNA。 并用分光光度計測定DNA 濃度和質(zhì)量。 土壤總DNA 質(zhì)量和濃度見表1。 由表1 可知，所獲得的DNA 可以滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 高通量測序數(shù)據(jù)分析

根據(jù)高通量測序數(shù)據(jù)，通過對雙蕊蘭根際土壤細菌16S rRNA 的V3～V4 可變區(qū)進行測序，共獲得26690 條原始序列，有效序列26471 條?；凇?7%的相似度水平，利用QIIME 軟件進行聚類分析，獲得有效的OTUs 共9556 個（表2）。 使用稀疏曲線對雙蕊蘭根際土壤樣品細菌的Alpha 多樣性指數(shù)（香濃指數(shù)、Chao1 指數(shù)和辛普森指數(shù)）進行評估，結(jié)果表明，稀釋曲線趨于飽和，證明此次測序的深度是合理的，繼續(xù)測序不會再產(chǎn)生較多新的OTU（圖1）。

表1 雙蕊蘭根際土壤總DNA 質(zhì)量和濃度Table 1 Total DNA quality and concentration in rhizosphere soil of Diplandrorchis sinica

表2 雙蕊蘭根際土壤細菌微生物多樣性指數(shù)Table 2 Soil sample sequence and α diversity index in rhizosphere of Diplandrorchis sinica

2.3 雙蕊蘭根際土壤細菌多樣性

通過對雙蕊蘭根際土壤高通量測序分析，共獲得9556 個OTUs，分屬于33 門，108 綱，210 目，324 科，472屬。 由圖2a 可知，雙蕊蘭根際土壤中優(yōu)勢細菌類群分別為：變形菌門（Protecbacteria）占41.86%；為放線菌門（Actinbacteria）占19.93%；擬桿菌門（Bacteroidetes）占9.57%；酸桿菌門（Acidobacteria）占9.01%；疣微菌門（Verrucomicrobia）占7.67%；浮霉菌門（Planctomycetes）占3.81%；綠彎菌門（Chloroflexi）占2.73%；泉古菌門（Crenarchoeota）占1.92%；其他菌門占3.5%。

由圖2b 可知，相對豐度在1%以上的15 個綱所占比例總和達到86.09%，分別為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria） 占20.39%； 嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）9.76%；β-變形菌綱（Betaproteobacteria）占9.27%；γ-變形菌綱 （Gammaproteobacteria） 占8.13%； 疣微菌綱（Spartobacteria） 占7.43%； 擬桿菌綱 （Saprospirae）占5.67%；放線菌綱（Actinobacteria）占5.99%；鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia） 占2.35%；δ-變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria） 占3.86%； 浮霉菌綱 （Planctomycetia）占3.06%；氯酸桿菌（Chloracidobacteria）綱占3.09%；酸微菌綱 （Acidimicrobiia） 占2.52%； 奇古菌綱（Thaumarchaeota）占1.90%；黃桿菌綱（Flavobacteriia）占1.21%，酸桿菌綱（Acidobacteria-6）占1.49%；其他菌綱占13.9%。

由圖2c 可知，在相對豐度大于1%時的21 個目所占比例總數(shù)可以占77.40%。相對豐度占比較高的9 個目依次是根瘤菌目（Rhizobiales）占16.68%；蓋勒氏菌目（Gaiellales）占7.01%；紅桿菌目（Chthoniobaceterales）占7.43%；腐螺旋菌目（Saprospirales）占5.67%；放線菌目（Actinomycetales）占5.84%；鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）占2.35%；伯克氏菌目（Burkholderiales）占4.11%；假單胞菌目（Pseudomonadales）占4.63%；酸微菌目（Acidimicrobales）占2.52%；其他菌目占46.28%。

圖1 雙蕊蘭根際土壤高通量測序稀釋性曲線Figure 1 High-throughput sequencing of soil in rhizosphere of Diplandrorchis sinica

圖2 瀕危物種雙蕊蘭根際細菌群落豐度分析Figure 2 Abundance analysis of rhizosphere bacteria community of endangered species Diplandrorchis sinica

從細菌科水平劃分，相對豐度大于1%的24 個科所占比例總數(shù)可達68.98%（圖2d）。 豐度較高的優(yōu)勢菌科主要有8 個科，分別為生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）占7.62%；蓋勒氏菌科（Gaiellaceae）占6.72%；紅桿菌科（Chthoniobacteraceae）占7.43%；噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）占5.62%；慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）占5.11%；鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）占2.22%；互營桿菌科（Syntrophobacteracea）占2.65%；假單胞菌科（Pseudomonadaceae）占4.63%；草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）占2.68%。 其他菌科占55.37%。

從細菌屬的水平上（圖2e）可知，相對豐度大于1%時的16 個屬所占比例達到53.69%，相對豐度較大的有6 個屬，依次為未分類的蓋氏屬（unclassified Gaiellaceae）占6.715%；紅游動菌屬（Rhodoplanes）占5.07%；慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）占4.69%；鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）占4.69%；假單胞菌屬（Pseudomonas）占4.62%；紫色桿菌屬（Janthinobacterium）占1.95%；其他菌屬占48%；還有一些無法歸類的菌屬占比為27.41%。

3 討論與結(jié)論

雙蕊蘭為腐生小草本，依附群落主要是櫟樹、楊樹和白樺樹為主的天然混交林。 下層被壓木主要有色木槭（A.mono Maxim.）、茶條槭（Ulmus pumila L.）、花曲柳（Fraxinus rhyncophylla）等，地被植物主要有忍冬（Lonicera japonica）、木賊（Equisetum hiemale L.）等。 雙蕊蘭主要生長在地被物稀少且坡度較緩的半陽坡山腹部。 這里土壤腐殖質(zhì)層較厚并有枯落物覆蓋[24]。 雙蕊蘭根際土壤pH 值可達到6.93，而非根際土壤pH 值僅為5.5，說明雙蕊蘭喜偏中性土壤生長，這可能也是影響雙蕊蘭生長的一個重要原因。 目前，關(guān)于蘭科植物根際細菌多樣性方面的研究較少，尤其針對瀕臨滅絕的單種屬物種雙蕊蘭根際微生物多樣性的研究尚未見報道。 本研究已初步獲得雙蕊蘭根際土壤細菌在不同分類水平上的相對豐度及優(yōu)勢菌群。 這些優(yōu)勢細菌類群主要涵蓋為八大類，其中變形菌門（Protecbacteria）是第一優(yōu)勢菌群，所占比例可達到41.87%；其次為放線菌門（Actinbacteria），占19.93%。 雙蕊蘭根際土壤細菌的優(yōu)勢菌屬主要是紅游動菌屬、慢生根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬、假單胞菌屬、紫色桿菌屬等。張劍等[25]通過研究大花杓蘭根際土壤細菌多樣性發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、馬賽菌屬以及分枝桿菌屬等，這與雙蕊蘭根際土壤細菌優(yōu)勢菌略有差異。 造成這種根際土壤細菌優(yōu)勢菌屬差異顯著的原因應(yīng)該是與植物營養(yǎng)、土壤類型及植物所生長的環(huán)境和根系分泌物等因素有關(guān)。 已有的一些研究結(jié)果表明，慢生根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬可以促進植物生長以及種子的萌發(fā)[25-26]。 國內(nèi)很多學(xué)者也已從蘭屬（Cymbidium）、石斛屬（Dendrobium）、斑葉蘭屬（Goodyera）等蘭花品種內(nèi)生細菌中分離鑒定出假單胞菌和芽孢桿菌為蘭科植物的優(yōu)勢菌種[27-31]。 但是在雙蕊蘭根際土壤中存在的優(yōu)勢菌屬是否也具有這些生物學(xué)功能，需要分離出雙蕊蘭根際土或肉質(zhì)根中的相關(guān)菌株才能被證實。 另外，在瀕危物種雙蕊蘭根際土壤中還存在大量的未確定分類地位的細菌，這些菌種資源還需充分挖掘和研究，才能從更深層次上揭示其瀕危機制。在根際土壤微生物中，細菌有很多種類通過各種復(fù)雜的機制影響著植物的生長發(fā)育，直接或間接地改變著土壤結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)；同時，土壤中的一些病原菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物影響著植物的生長和發(fā)育[32]。 植物在生長過程中利用根系從土壤中吸收水分及礦質(zhì)營養(yǎng)滿足自身生長[33-35]，并通過根際向土壤中釋放代謝產(chǎn)物影響土壤微生物群落多樣性，通過各種途徑影響根際土壤微環(huán)境。 因此，在土壤中，植物根際、微生物群落之間存在著重要的相互作用，在有限的生存空間中競爭著土壤微環(huán)境空間及營養(yǎng)資源。 目前，關(guān)于植物與土壤微生物之間的互相影響已愈來愈受到研究者的關(guān)注，但其互作的機理尚未深入研究，尤其是蘭科植物。BEVER[36]研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落組成與森林植被類型關(guān)系密切，不同的植被類型影響著土壤微生物的組成和活性。 同一環(huán)境植被類型不同土壤微生物群落組成也會隨著小環(huán)境的變化而不同，對于某一特定森林生態(tài)系統(tǒng)，環(huán)境因子穩(wěn)定，土壤微生物數(shù)量和活性也會隨著小環(huán)境的植被群落組成和結(jié)構(gòu)而發(fā)生變化[35-36]。

本研究利用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)對珍稀瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細菌多樣性進行初步研究，結(jié)果表明，瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細菌多樣性較為豐富，在門、綱、目、科、屬分類水平上雙蕊蘭根際土壤的優(yōu)勢細菌類群主要為變形菌門（Protecbacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）和未被確定分類的蓋氏菌屬。 這些研究結(jié)果首次揭示了瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細菌群落的多樣性，為進一步探討雙蕊蘭及其與根際細菌的相互關(guān)系以及雙蕊蘭的繁殖及瀕危機制奠定了研究基礎(chǔ)。