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    番紅花多柱頭突變體Cs5的轉(zhuǎn)錄組分析

    2021-01-29 10:44:14李軍,吳霽蓂,高廣春,朱志明,李白,蔣琦,周鴻宇
    關(guān)鍵詞:番紅花轉(zhuǎn)錄組柱頭

    李軍,吳霽蓂,高廣春,朱志明,李白,蔣琦,周鴻宇

    關(guān)鍵詞:番紅花;柱頭;突變體;轉(zhuǎn)錄組

    中圖分類號:S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1000-4440(2021)06-1630-03

    Transcriptome analysis of saffron mutant Cs5 with multiple stigmas

    LI Jun1,WU Ji-ming2,GAO Guang-chun2,ZHU Zhi-ming3,LI Bai4,JIANG Qi2,ZHOU Hong-yu2

    (1. School of Modern Agriculture, Jiaxing Vocational & Technical College, Jiaxing 314036, China;2.School of Medicine Science, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China;3.Jiaxing Xiuzhou Tianhe Saffron Professional Cooperative, Jiaxing 314000, China;4.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, Jiaxing 314016, China)

    Key words: saffron;stigma;mutant;transcriptome

    番紅花(Crocus sativus L.)為鳶尾科番紅花屬球莖類藥用植物,以其干燥柱頭入藥,具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效,同時(shí)也應(yīng)用于食品、化妝品行業(yè)染料及香料的制作[1-2]。番紅花在浙江、江蘇、上海、四川等地廣泛栽培,但全國種植面積不到667 hm2,占市場需求量的20%左右,大部分還是依賴進(jìn)口,因此番紅花的需求量非常大。然而,由于番紅花為三倍體雄性不育植物,僅靠球莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖,而且每一朵花只有3個(gè)柱頭,所以產(chǎn)量極低[3-4]。因此,培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的番紅花品種將有效緩解國內(nèi)外番紅花市場的供求矛盾,具有重要的基礎(chǔ)理論研究價(jià)值和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

    野生型番紅花的花為頂生;花被片6個(gè),淡紫色,長4~6 cm;雄蕊3個(gè),雌蕊三心皮合生,子房下位,花柱細(xì)長,黃色柱頭3個(gè),伸出花被筒外后下垂,深紅色,頂端略膨大。本研究在番紅花生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)了多柱頭突變體Cs5,其雌蕊上端花柱和柱頭數(shù)量均為5個(gè),形態(tài)與野生型無異,花柱聚合后比野生型粗壯(圖1)。柱頭數(shù)量的增多有助于提高番紅花花絲的產(chǎn)量及花農(nóng)收入,是番紅花新品種培育的主要方向。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué),結(jié)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析番紅花柱頭發(fā)育的調(diào)控基因AGL6,發(fā)現(xiàn)其可能通過影響花器官的發(fā)育進(jìn)而影響柱頭的生物量,最終影響次生代謝物的產(chǎn)量[2,5-6]。番紅花柱頭數(shù)量是影響產(chǎn)量的一個(gè)重要指標(biāo),調(diào)控其生長發(fā)育的結(jié)構(gòu)基因的挖掘和調(diào)控機(jī)制的研究有助于解決番紅花資源短缺問題,然而目前相關(guān)研究報(bào)道較少。

    目前,RNA-Seq分析測試技術(shù)在植物特異突變、特定發(fā)育時(shí)期以及不同組織器官基因差異表達(dá)等方面的研究中廣泛應(yīng)用[7-9]。本研究擬對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭及其野生型柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)比較分析,篩選差異表達(dá)基因,分析基因功能以及相關(guān)的代謝通路,以期為研究影響番紅花柱頭數(shù)量的相關(guān)調(diào)控基因及相關(guān)信號通路提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    番紅花多柱頭突變體Cs5樣本為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院番紅花種植基地里的自然突變體,其雄蕊、花柱和柱頭的數(shù)量均為5個(gè),均比野生型多2個(gè)。于盛花期分別采集番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的柱頭,每10個(gè)1組,設(shè)3次重復(fù),于-80 ℃超低溫冰箱中凍存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

    取各處理組的樣品各0.1 g,液氮研磨,采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取柱頭的總RNA,在Illumina HiSeq2500儀器(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品)上進(jìn)行RNA-Seq測序。

    1.2差異表達(dá)基因分析和功能注釋

    采用Trinity軟件將各處理組的有效數(shù)據(jù)組裝成對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列,用Blast軟件將各樣品測序得到的所測讀段與Unigene庫進(jìn)行比對,利用DESeq軟件以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05且log2 Fold Change≥1為條件篩選差異表達(dá)基因(DEGs)。使用Blast軟件將DEGs與NR、SWISS、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行比對,獲得相應(yīng)的注釋信息。

    1.3差異表達(dá)基因的驗(yàn)證及表達(dá)模式分析

    分別選取10個(gè)差異表達(dá)基因,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的可靠性,以及差異表達(dá)基因在花瓣、葉片、球莖、雄蕊、柱頭等不同組織中的表達(dá)模式。實(shí)時(shí)熒光定量PCR:總反應(yīng)體積20 μl,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)為40個(gè),72 ℃延伸30 s。用2-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)差異。

    差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證和表達(dá)模式分析的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1基因組裝分析

    利用Illumina HiSeq2500儀器進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測序,番紅花多柱頭突變體Cs5產(chǎn)生了60 063 054條序列數(shù),野生型產(chǎn)生了54 706 306條序列數(shù),各處理組的G、C基本隨機(jī)分布,無明顯偏差。質(zhì)量控制分析后,突變體保留54 984 766條序列,野生型保留49 715 722條序列。采用Trinity軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝,對得到的52 317條Unigenes分別進(jìn)行功能注釋,其中NR數(shù)據(jù)庫29 392條,GO數(shù)據(jù)庫20 510條,COG數(shù)據(jù)庫21 126條,KEGG數(shù)據(jù)庫12 875條,SWISS數(shù)據(jù)庫20 510條,其中NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高,達(dá)56.18%。

    2.2差異表達(dá)基因分析

    對番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,共篩選出917個(gè)差異表達(dá)基因,其中番紅花多柱頭突變體Cs5中有412個(gè)(約占44.93%)基因表達(dá)上調(diào),505個(gè)(約占55.07%)基因表達(dá)下調(diào)。顯著差異表達(dá)基因中包括MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因15個(gè)(包含9個(gè)已鑒定的番紅花MADS類轉(zhuǎn)錄因子基因),MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因19個(gè),BHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因7個(gè),WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因5個(gè),SEUSS家族轉(zhuǎn)錄因子基因6個(gè),TF1轉(zhuǎn)錄因子基因1個(gè),與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因23個(gè),這些轉(zhuǎn)錄因子基因大多與植物花發(fā)育相關(guān)。

    2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性,從917個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因(包含3個(gè)上調(diào)表達(dá)基因,7個(gè)下調(diào)表達(dá)基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn),這10個(gè)基因的表達(dá)情況與測序結(jié)果一致,說明本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實(shí)可信。

    2.4DEGs的GO功能注釋分析

    對番紅花多柱頭突變體DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析,有316個(gè)基因被注釋到41個(gè)分類條目上,包括145個(gè)上調(diào)基因和171個(gè)下調(diào)基因。這些基因功能分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類,分別包含141、103、72個(gè)條目。對這3類條目的二級分類結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)DEGs在生物過程條目中主要分布在細(xì)胞過程和代謝過程,在細(xì)胞組分條目中主要包括共質(zhì)體和細(xì)胞膜等,在分子功能條目中主要包括結(jié)合活性和催化活性。

    2.5DEGs的KEGG功能注釋分析

    通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對,對所有DEGs進(jìn)行功能注釋和富集分析。結(jié)果顯示,917個(gè)差異表達(dá)基因被富集在179個(gè)代謝通路中,以校正P值<0.05為條件篩選出20個(gè)顯著富集的代謝通路,包括次生代謝產(chǎn)物生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、淀粉和蔗糖代謝等。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中富集了5個(gè)差異表達(dá)基因,涉及生長素、赤霉素、脫落酸的代謝通路,植物激素在植物生長發(fā)育的不同時(shí)期和不同組織器官中均發(fā)揮重要的作用,番紅花多柱頭突變體Cs5的性狀很有可能與激素表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

    2.6DEGs表達(dá)模式分析

    從917個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取10個(gè)差異表達(dá)基因,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其在番紅花不同組織器官里的表達(dá)情況。本研究結(jié)果表明,DN34196、DN30594、DN41391、DN24459和DN39219共5個(gè)差異表達(dá)基因在番紅花柱頭中的表達(dá)量與其在雄蕊、花瓣、葉片和球莖中的表達(dá)量有極顯著差異(P<0.01);DN26020在番紅花柱頭中的表達(dá)量與其在雄蕊和花瓣中的表達(dá)量無顯著差異,與其在葉片和球莖中的表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.01);DN17686和DN31280在柱頭中的表達(dá)量與其在葉片中的表達(dá)量無顯著差異,與其在雄蕊、花瓣和球莖中的表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.01)。

    3討論

    番紅花作為經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的藥用植物,藥用部位的產(chǎn)量一直是科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)[10-11]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭和野生型番紅花柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,從中發(fā)現(xiàn)可能與柱頭發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括MADS家族、MYB家族、BHLH家族、WRKY家族、SEUSS家族以及與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。另外,番紅花突變體中MADS-box基因包含A Class (AP1)、B Class (PI/AP3)、C Class(AG)、D Class(AGL)和E Class(SEP),說明番紅花花發(fā)育過程也涉及到5類基因在不同時(shí)間和空間的精確表達(dá)[6]。

    植物自身激素水平在雌蕊發(fā)育過程中扮演著重要角色,本研究發(fā)現(xiàn)一批與生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和脫落酸的合成、失活及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,通過這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以維持植物包括雌蕊在內(nèi)的花器官的正常發(fā)育[12-13]。番紅花柱頭的發(fā)育質(zhì)量和數(shù)量直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值,多柱頭突變體的發(fā)現(xiàn)一方面可以為通過組培快繁技術(shù)快速擴(kuò)繁突變體數(shù)量,提高番紅花產(chǎn)量的研究提供試驗(yàn)材料,另一方面本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)使得解析多柱頭突變體形成機(jī)制,以及通過生物技術(shù)調(diào)控、創(chuàng)制更多突變體成為了可能。隨著基因組﹑轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高,相信將來在番紅花柱頭生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的一些蛋白質(zhì)生物學(xué)功能和基因間互作關(guān)系的研究會(huì)有更大突破。

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    (責(zé)任編輯:王妮)

    收稿日期:2021-04-12

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81703667);嘉興市公益性研究計(jì)劃項(xiàng)目(2020AY10023);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2020R417016);嘉興市科技特派員專項(xiàng)項(xiàng)目(2021K117);嘉興學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力個(gè)性化培養(yǎng)項(xiàng)目

    作者簡介:李軍(1981-),男,山東泰安人,博士,副研究員,主要從事植物分子生物學(xué)研究。(E-mail)lijunjx1@163.com

    通訊作者:高廣春,(E-mail)gaogcjx@163.com

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