高產(chǎn)酯化酶細(xì)菌的復(fù)合誘變選育及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

趙志軍，張艷珠,3，劉延波，周平平，葛少華，孫西玉*

1(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 酒業(yè)學(xué)院，河南 鄭州，450046)2(寶豐酒業(yè)有限公司，河南 平頂山，467500)3(寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波，315211)

中國白酒作為全球消費量最大的蒸餾酒[1]，是以糧谷為主要原料，在酒曲等糖化發(fā)酵劑的作用下，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而成[2]。白酒的發(fā)酵是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果[3]，微生物代謝產(chǎn)生種類繁多的微量有機化合物構(gòu)成了白酒獨特的“香和味”[4-6]。白酒中含有約2%的呈香呈味物質(zhì)決定著酒體的品質(zhì)[7]。其中酯類的含量最為豐富，其含量高低是影響白酒質(zhì)量和風(fēng)格的主要因素[8-9]。通常來說，優(yōu)質(zhì)白酒中的酯含量也相對較高。

酯化酶亦稱為羧基酯酶，是微生物產(chǎn)酯過程中的關(guān)鍵酶，能夠催化低級脂肪酸酯的合成[10]。產(chǎn)酯微生物的產(chǎn)酯化酶能力提升，能夠增加白酒中酯類的含量進而提升白酒品質(zhì)[11]。因此，篩選高產(chǎn)酯化酶微生物并強化其產(chǎn)酶能力，對白酒的生產(chǎn)及質(zhì)量的提高具有非常重要的意義。謝軍等[12]從酒曲中篩選得到具備酯化力的酵母菌和霉菌。田宇敏[13]從清香型白酒酒醅中分離得到產(chǎn)香的白地霉。單淑芳等[14]篩選出酯化力較強的紅曲霉。趙志軍等[15]從窖泥中篩選得到酯化型細(xì)菌。諸多產(chǎn)酯微生物的獲得，為其在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

理化誘變是一種獲得優(yōu)良菌種的有效方式[16]。紫外線(ultraviolet，UV)誘變具有操作簡便，效果好、安全性高的特點[17-18]，是微生物誘變育種中較為常用的手段。硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)是一種烷化誘變劑，常用于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的選育，效果顯著[19-20]。復(fù)合誘變是將兩種及兩種以上的誘變方法結(jié)合使用，形成誘變互補優(yōu)勢，與單因素誘變相比效果更好。SONG等[21]通過高能碳重離子輻照和NaNO2聯(lián)合處理，獲得了1株高產(chǎn)阿維菌素B1a的突變體。劉文龍等[22]采用UV-等離子體復(fù)合誘變選育出了高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株；劉剛等[23]通過UV-DES復(fù)合誘變篩選出了高產(chǎn)胞外多糖突變株。以上研究均表明利用復(fù)合誘變技術(shù)，使得菌株原有有益性狀得到較大幅度的提升。

目前，對產(chǎn)酯化酶微生物的研究以酵母和霉菌居多，細(xì)菌的研究較少，對產(chǎn)酯化酶細(xì)菌的復(fù)合誘變選育未見報道。本研究以先期篩選獲得的貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)為出發(fā)菌株，對其進行UV-DES復(fù)合誘變選育，獲得高產(chǎn)酯化酶菌株，并進行固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化。該研究有望獲得高產(chǎn)酯化酶細(xì)菌菌株，為提高白酒優(yōu)質(zhì)酒出產(chǎn)率提供有價值的可參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)Nz 1.201[15],由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院白酒風(fēng)格工程技術(shù)中心分離并保藏。

1.1.2 試劑

生化試劑牛肉膏、蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；生化試劑瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司；分析純無水乙醇、葡萄糖、NaOH,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三丁酸甘油酯、色譜純硫酸二乙酯(分析純),上海麥克林生化科技有限公司；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA),上海臣啟化工科技有限公司；HCl(分析純),南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，調(diào)pH至5.0。

固體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂粉20，調(diào)pH至5.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏20.0，葡萄糖20.0，NaCl 0.5，K2HPO41.0，(NH4)2SO41.0，SO4·7H2O 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，調(diào)pH至5.0。

初篩培養(yǎng)基：細(xì)菌液體培養(yǎng)基與乳化液按體積比9∶1混合，瓊脂粉20 g/L，并充分混勻；

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：250 mL三角瓶中裝入含水量調(diào)整為60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的麩皮100 g。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。

PVA溶液：稱取3 g PVA于100 mL蒸餾水中，邊加熱邊攪拌，使其完全溶解，并用無菌紗布過濾。

乳化液：PVA溶液和三丁酸甘油酯按體積比9∶1混合，并充分搖勻。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9272BS恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZQLY-300S恒溫培養(yǎng)搖床，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；H1850R臺式冷凍高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DHG-9143BS電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初始菌株酯化酶酶活力測定

取出-20 ℃保藏的菌株Nz 1.201，接種于試管斜面固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使其活化。將活化后菌種，接種到種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。按3%的接種量，將種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃的培養(yǎng)箱中，每隔24 h搖瓶一次，培養(yǎng)6 d，即為麩曲。將其倒于已滅菌的牛皮紙上，置于干燥箱中30 ℃烘干，密封保存。

酯化酶酶活力測定：參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中酯化力的測定方法[24]。

酯化酶酶活力定義為：每100 g大曲在35 ℃，經(jīng)過7 d催化，己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為1個酶活力單位(U/100g)。

1.3.2 復(fù)合誘變及篩選

對出發(fā)菌株進行UV誘變，篩選出酶活力最高的菌株，之后進行DES誘變，并從中篩選出酶活力進一步提高的突變株，隨即進行遺傳性能檢測。

1.3.2.1 UV誘變及篩選

挑取斜面培養(yǎng)基上的出發(fā)菌株，接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)36 h至對數(shù)期中期，制備成菌懸液。

取菌懸液5 mL置于滅菌的直徑9 cm培養(yǎng)皿中，置于UV誘變燈正下方50 cm處，打開皿蓋，準(zhǔn)確記時，處理時間分別為0、0.5、1、2、3、4、5 min。對每個處理樣品均進行梯度稀釋，取0.1 mL稀釋液涂布培養(yǎng)基平板，30 ℃倒置暗培養(yǎng)3 d，觀察記錄。統(tǒng)計菌落，計算致死率，選擇致死率為70%～90%作為UV最佳照射時長[25]，計算如公式(1)所示：

(1)

根據(jù)最佳UV照射時長對出發(fā)菌株進行UV誘變，之后進行系列稀釋、涂布，并于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)3 d，觀察記錄。

從平板上挑取長勢良好的菌株，點接種于初篩培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察菌落周圍的透明圈，記錄透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比HC值。選取HC值大的菌株進行固態(tài)發(fā)酵，測定其酯化酶酶活力，具體方法同1.3.1。

1.3.2.2 DES誘變及篩選

將UV誘變獲得的菌株制備成菌懸液。各取10 mL，分別加入一定量的DES，形成DES含量為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL/mL的6個誘變濃度梯度，以不加DES為空白對照。在30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床振蕩30 min，然后加入1 mL 20 g/L Na2S2O3終止誘變反應(yīng)[26]。將處理后的菌懸液稀釋涂布，30 ℃下培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算致死率。選擇致死率為80%～90%為DES最佳誘變劑量，致死率計算如公式(2)所示：

(2)

選取最佳DES誘變劑量對菌懸液進行誘變，按1.3.2.1方法對突變株進行篩選。

1.3.2.3 遺傳穩(wěn)定性測定

對復(fù)合誘變獲得的酯化酶酶活力顯著提高的突變株進行連續(xù)傳代5次培養(yǎng)，測定其酶活力，以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量、原料含水量進行單因素試驗，因素水平設(shè)計具體見表1。

表1 單因素水平設(shè)計表

1.3.3.2 酯化酶酶活力測定

進行酯化酶酶活力測定，具體方法同1.3.1。

1.3.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇對菌株酯化酶酶活力影響較大的3個因素作為自變量，以酶活力為響應(yīng)值(Y)，利用Design-Expert軟件設(shè)計Box-Behnken試驗，確定最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵條件并對其進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株酯化酶酶活力測定

對菌株Nz 1.201進行酯化酶酶活力測定，測得其酶活力為37.70 U/100g。

2.2 復(fù)合誘變及篩選

2.2.1 UV誘變結(jié)果

對出發(fā)菌株進行UV照射，測定不同照射時長菌株的致死率，結(jié)果見圖1。在一段時間內(nèi)，隨著UV照射時間的延長，菌株的致死率急劇增大，當(dāng)照射時間為3 min時，菌株致死率約為82%，此時正突變率最大，以此作為UV誘變最佳照射時間。

圖1 UV照射時間對菌體致死率的影響

2.2.2 UV誘變篩選

以UV照射3 min對出發(fā)菌株Nz 1.201進行處理，之后進行梯度稀釋，涂布初篩培養(yǎng)培養(yǎng)皿上，于30 ℃倒置暗培養(yǎng)3 d。獲得長勢良好的菌株30株，編號為B1～B30，選取HC值大的10株菌株進行固態(tài)發(fā)酵，并測定其酯化酶酶活力，結(jié)果見表2。

表2 UV誘變突變株的HC值及酯化酶酶活力測定

由表2可知，突變株B28酯化酶酶活力最高，達(dá)48.52 U/100g，較原始菌株Nz 1.201提高了約29%。

2.2.3 DES誘變

將菌株B28制成菌懸液，測定在不同濃度的DES處理條件下B28的致死率，測定結(jié)果見圖2。

圖2 DES含量對菌體致死率的影響

由圖2可知，當(dāng)DES含量為3 μL/mL時，菌株B28致死率約為89%，以此作為DES處理的最佳濃度。

2.2.4 DES誘變篩選

以DES含量為3 μL/mL對B28進行處理，獲得菌株共計40株，編號為D1～D40，從中挑選出HC值較大的12株菌株進行固態(tài)發(fā)酵，測定其酯化酶酶活力，結(jié)果見表3。

表3 DES誘變突變株的HC值及酯化酶酶活力測定

由表3可知，突變株D27酯化酶酶活力最高，70.90 U/100g，較B28酶活力提高了約46%，較原始菌株Nz 1.201酶活力提高了88%。因此，選取D27作為遺傳穩(wěn)定性測定及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化菌株。

2.3 遺傳穩(wěn)定性測定

將篩選到的突變菌株D27連續(xù)傳代培養(yǎng)，對連續(xù)培養(yǎng)的5代菌株進行酯化酶酶活力測定，以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，測定結(jié)果見圖3。

圖3 突變株的遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果

由圖3可知，在對突變株D27進行第3～5次傳代時，酯化酶酶活力趨于穩(wěn)定，為62.45 U/100g，較出發(fā)菌株酯化酶酶活力提高了66%。由此可知經(jīng)UV-DES復(fù)合誘變得到的突變株D27具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 單因素試驗

2.4.1 培養(yǎng)溫度對菌株酯化酶酶活力的影響

由圖4可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著培養(yǎng)溫度的升高先增大后減小。培養(yǎng)溫度對菌株影響較大，培養(yǎng)溫度較低時，菌株的生長較慢，酶的分泌量少，酶活力較低；隨著培養(yǎng)溫度的升高，微生物代謝旺盛，酶的分泌量逐漸增加，酶活力增大；在培養(yǎng)溫度為33 ℃時，菌株D27的酯化酶酶活力達(dá)到最大值為85.74 U/100g；培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，不利于菌株生長，酶產(chǎn)量和積累量減少，酶活力降低。

圖4 不同培養(yǎng)溫度菌株酶活力的影響

2.4.2 培養(yǎng)時間對菌株酯化酶酶活力的影響

培養(yǎng)時間對菌株酯化酶酶活力的影響見圖5。

圖5 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活力的影響

由圖5可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著培養(yǎng)時間的增加先增大后減小。培養(yǎng)時間較短時，菌株未能充分生長繁殖，酶的分泌量和積累量較少，酶活力較低；隨著培養(yǎng)時間的延長，酶的分泌量和積累量逐漸增加，酶活力升高；在培養(yǎng)時間為6 d時，菌株D27的酯化酶酶活力達(dá)到最大值為88.81 U/100g；培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，培養(yǎng)基質(zhì)被大量消耗，菌株進入衰亡期，產(chǎn)酶量逐漸減少，部分酶開始失活，酶活力下降。

2.4.3 接種量對菌株酯化酶酶活力的影響

接種量對菌株酯化酶酶活力的影響結(jié)果見圖6。

圖6 不同接種量對菌株酶活力的影響

由圖6可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著接種量的增加先增大后減小。在接種量為3%時，菌株D27的酯化酶酶活力最大為82.27 U/100g；接種量繼續(xù)增加，微生物大量生長加快了對基質(zhì)的消耗，產(chǎn)酶量降低，酶活力急劇下降。

2.4.4 原料含水量對菌株酯化酶酶活力的影響

原料含水量對菌株酯化酶酶活力的影響結(jié)果見圖7。

圖7 不同原料含水量對菌株酶活力的影響

由圖7可知，菌株D27的酯化酶酶活力隨著原料含水量的增加先增大后減小。原料含水量過少，抑制微生物的生長代謝，酶的分泌量較少，酶活力較低；隨著含水量的增加，微生物生長代謝增加，酶活力顯著提高；在原料含水量為70%時，菌株D27的酯化酶酶活力最大為88.24 U/100g；繼續(xù)增大原料含水量，固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生粘黏現(xiàn)象，透氣性較差，不利于微生物的生長代謝及酶活積累，產(chǎn)酶量減少，酶活力降低。

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素分析結(jié)果，選取對菌株酯化酶酶活力影響較大的培養(yǎng)時間、接種量、原料含水量3因素作為自變量，以酯化酶酶活力為響應(yīng)值(Y)，采用Design Expert軟件設(shè)計響應(yīng)面分析試驗。對數(shù)據(jù)進行回歸分析，確定最佳固態(tài)發(fā)酵條件，并設(shè)計試驗進行驗證。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計試驗因素水平表，見表4。

表4 Box-Behnken 試驗因素與水平

2.5.1 模型方差分析及響應(yīng)面分析

依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表5所示。

表5 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件對表5數(shù)據(jù)進行二次回歸方程擬合，得到菌株酯化酶酶活力對培養(yǎng)時間(A)、接種量(B)及原料含水量(C)的多元二次回歸方程：酯化酶酶活力=88.49-1.23×A-2.03×B+3.52×C+0.18×A×B-4.82×A×C+0.62×B×C-13.33×A2-7.88×B2-3.28×C2具體結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

2.5.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確認(rèn)培養(yǎng)時間、接種量和原料含水量對酯化酶酶活力的影響，響應(yīng)面曲面和等高線見圖8。

a～b,接種量和培養(yǎng)時間；c～d，原料含水量和培養(yǎng)時間；e～f，接種量和原料含水量

2.5.3 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件分析，培養(yǎng)溫度為33 ℃時，固態(tài)發(fā)酵最佳條件為培養(yǎng)時間5.67 d、接種量2.90%、原料含水量73.23%，在此條件下酯化酶酶活力的理論值為89.84 U/100g?？紤]到實際操作可行性，在培養(yǎng)溫度為33 ℃時，選擇固態(tài)發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間6 d、接種量3%、原料含水量73%進行驗證試驗。

對突變株D27進行固態(tài)發(fā)酵驗證，測得優(yōu)化后的酯化酶酶活力為89.52 U/100g，較出發(fā)菌株酶活提升了137%，驗證結(jié)果與響應(yīng)面試驗預(yù)測結(jié)果基本一致，說明優(yōu)化條件方案可行。

3 結(jié)論

本研究利用UV-DES復(fù)合誘變處理產(chǎn)酯化酶菌B.velezensisNz1.201，獲得了酯化酶酶活顯著提高且遺傳性能穩(wěn)定的突變菌株B.velezensisD27，其酯化酶酶活為62.45 U/100g，比初始菌株提高了66%?；趩我蛩貙嶒灥捻憫?yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示，該菌株的最佳固態(tài)發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度33 ℃、培養(yǎng)時間6 d、接種量3%、原料含水量73%。在此條件下，B.velezensisD27的酯化酶活力最高可達(dá)89.52 U/100g，較初始菌株酶活提高了137%。綜上所述，本研究獲得了1株高產(chǎn)酯化酶菌株，為產(chǎn)酯化酶細(xì)菌的固態(tài)培養(yǎng)提供了重要的參考依據(jù)，對產(chǎn)酯化酶細(xì)菌在白酒生產(chǎn)中提高優(yōu)質(zhì)酒出產(chǎn)率領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。