永春老醋不同生產(chǎn)階段細(xì)菌和真菌多樣性動(dòng)態(tài)變化特征分析

王俊奇，黃衛(wèi)紅，李雙彤，袁建軍，陳洪彬，馬應(yīng)倫，張秋芳*

1(泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州，362000)2(永春老醋醋業(yè)有限責(zé)任公司，福建 泉州，362000)

福建永春老醋，別名福建紅曲陳醋，是我國(guó)四大名醋之一，其產(chǎn)品特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生一種令人愉快的香氣，食用起來具有酸而不澀、酸中有甜和濃香醇厚的獨(dú)特風(fēng)味，其產(chǎn)品是以紅曲、糯米、芝麻和白糖等為主要原料，在不同微生物共同參與下完成的生物轉(zhuǎn)化的液態(tài)發(fā)酵過程中形成[1-4]，細(xì)菌和真菌的組成隨著陳醋生產(chǎn)階段不同而發(fā)生變化，對(duì)陳醋品質(zhì)形成過程起著不同作用，在醋醅發(fā)酵過程中，菌群數(shù)量變化主要體現(xiàn)在酵母菌和細(xì)菌數(shù)量的變化，酵母菌和細(xì)菌數(shù)量均呈先增后減的趨勢(shì)，相比之下其他菌群的數(shù)量則較小[5]。釀造過程中微生物群落的變化對(duì)食醋的風(fēng)味具有重要影響，研究發(fā)現(xiàn)食醋釀造中細(xì)菌群落對(duì)風(fēng)味的相關(guān)性高于真菌群落，表明細(xì)菌群落是醋味的主要生產(chǎn)者[6]。高通量測(cè)序技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速和高效的檢測(cè)性能，已成為當(dāng)前研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的主流技術(shù)[7]，該技術(shù)在食品微生物領(lǐng)域的研究也越來越受關(guān)注。目前，對(duì)永春老醋微生物的報(bào)道多為傳統(tǒng)的微生物菌種構(gòu)建、優(yōu)勢(shì)菌分離純化以及菌種保藏等研究[8-9]，運(yùn)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析永春老醋不同品質(zhì)階段細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌群變化趨勢(shì)的研究尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，分別以16S rRNA和18S rRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)發(fā)酵中、1個(gè)月成品、1年陳釀和10年陳釀4個(gè)主要品質(zhì)形成階段的永春老醋中細(xì)菌與真菌群落多樣性動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，擬獲得永春老醋不同階段具有優(yōu)勢(shì)作用的微生物群落組成特征，為初步探究永春老醋不同階段微生物組成變化對(duì)食醋風(fēng)味的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

于福建省永春老醋醋業(yè)有限責(zé)任公司采集發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個(gè)具有代表性的不同生產(chǎn)和保存階段樣品，分別各自混勻后，各取200 mL，用0.22 μm的水系微孔濾膜(Merck Millipore公司，美國(guó))進(jìn)行抽濾，將抽濾后收集有微生物的濾膜存放在-80 ℃下，經(jīng)凍干后的樣品用于總DNA提取。

1.2 樣品總DNA提取

用消毒剪刀將收集有微生物的濾膜剪碎，采用FastDNA Spin Kit For Soil試劑盒(MP Biomedicals公司，美國(guó))提取總DNA，應(yīng)用核酸提取儀(MP Biomedicals公司，美國(guó))，均質(zhì)條件為18 s和4.5 m/s，提取步驟參照說明書進(jìn)行。將獲得的總DNA用70 μL DES溶液收集，核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度和純度后貯存于-80 ℃下備用。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增及測(cè)序

用帶有Barcode序列[10]的引物對(duì)338F/806R[11]和817f/1196r[12]分別作為細(xì)菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因引物。其中，16S rRNA基因用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGTWTCTAA-3′；18S rRNA基因用引物817f：5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196r：5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。分別用16S rRNAX和18S rRNA基因引物對(duì)提取的樣品總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rRNA基因擴(kuò)增條件：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min(33個(gè)循環(huán))，72 ℃、5 min。18S rRNA基因擴(kuò)增條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、45 s(35個(gè)循環(huán))，72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，取足夠量送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在Illumina Miseq平臺(tái)上測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

去除原始序列中的引物序列與Barcode序列，得到PE-reads，利用Flash軟件[13]將所得到的PE-reads拼接成一條序列，并用QⅡME v.1.7.0軟件進(jìn)行分析[14]。運(yùn)用Uclust軟件[13]以97%的閾值進(jìn)行操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)劃分，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)序列聚類。然后通過核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目(ribosomal database project，RDP)Classifier軟件[15]和SILVA數(shù)據(jù)庫[16]將提取出來的每個(gè)OTU序列的分類信息進(jìn)行注釋。利用Mothur v1.30.1軟件對(duì)相似水平高于97%的OTUs進(jìn)行α-多樣性分析，內(nèi)容包括覆蓋率(Coverage)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，從而評(píng)估單樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。通過R語言統(tǒng)計(jì)和作圖工具來進(jìn)行物種組成分析，包括物種Venn圖和群落組成分析[17]，運(yùn)用R語言軟件進(jìn)行層級(jí)聚類分析，對(duì)微生物的β-多樣性進(jìn)行分析。獲得的16S rRNA和18S rRNA基因DNA序列已收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫的Sequences Read Archive(SRA)，登錄號(hào)分別為SRP222992和SRP222989。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

由表1可知，4個(gè)階段永春老醋樣品中微生物Coverage指數(shù)均大于0.99，說明樣品中絕大多數(shù)DNA序列都被測(cè)出，即測(cè)序深度可以反映出樣品中微生物的真實(shí)情況。就細(xì)菌而言，除在10年陳釀(Y4)樣品中未檢測(cè)到外，前3個(gè)階段樣品之間細(xì)菌的OTU總數(shù)區(qū)別不大，其中1個(gè)月成品(Y2)的OTU數(shù)量相對(duì)較高；1個(gè)月成品(Y2)的Chao指數(shù)最大，物種豐富度最大；3個(gè)樣品的Shannon指數(shù)區(qū)別不大，說明前3個(gè)階段的細(xì)菌生物多樣性差別較小。就真菌而言，1年陳釀(Y3)的OTU數(shù)量最少，而且1個(gè)月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)與發(fā)酵中(Y1)、10年陳釀(Y4)的OTU總數(shù)相差較大；1個(gè)月成品(Y2)的Chao指數(shù)最小，物種豐富度最小，發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的Shannon指數(shù)差別不大，但是10年陳釀(Y4)比其他樣品高很多，說明前3個(gè)階段樣品的真菌多樣性差別較小，10年陳釀(Y4)的真菌多樣性較好。以上可以得出，永春老醋前3個(gè)階段中細(xì)菌物種豐度顯著高于真菌，而在10年陳釀(Y4)中，真菌生物的豐度大幅增加，可能是由于貯存10年后老醋中的優(yōu)勢(shì)菌群為酵母菌。

表1 永春老醋不同階段α-多樣性指數(shù)

2.2 物種Venn圖分析

如圖1-a所示，發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中的OTU數(shù)一共為27個(gè)。3個(gè)樣品共有的OTU數(shù)為19個(gè)，除發(fā)酵中(Y1)特有1個(gè)OTU外，其他樣品無特有OTU存在。說明3個(gè)樣品物種組成較為相似，單獨(dú)存在于各樣品的物種極少；真菌OUT數(shù)量如圖1-b所示，4個(gè)階段樣品中的OTU數(shù)一共為24個(gè)，4個(gè)樣品中共有的OTU數(shù)為8個(gè)，單獨(dú)存在于發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和10年陳釀(Y4)的OTU數(shù)分別為5、1和7，相比較而言，發(fā)酵中(Y1)和10年陳釀(Y4)的真菌群落組成較為特殊。

a-OTU水平下細(xì)菌韋恩圖；b-OTU水平下真菌韋恩圖

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.3.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門水平下，永春老醋在發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中共檢測(cè)出2類細(xì)菌物種。

由圖2可知，3個(gè)階段樣品主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種均為變形菌門(Proteobacteria)，相對(duì)豐度分別為67.44%、68.46%和75.14%；其次是厚壁菌門(Firmicutes)，相對(duì)豐度分別為32.53%、31.51%和24.85%。結(jié)果表明，3個(gè)階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相近，只是1年陳釀(Y3)樣品的組成比例與前兩個(gè)階段稍有差異。變形菌門中大部分為好氧型或自養(yǎng)型細(xì)菌，永春老醋發(fā)酵和前期貯存過程中攪拌通氧、產(chǎn)酸環(huán)境為這些細(xì)菌提供了有利的生長(zhǎng)環(huán)境，使這類細(xì)菌相對(duì)豐度較高；厚壁菌門中大多數(shù)為厭氧細(xì)菌，這類細(xì)菌能在高酸環(huán)境下生長(zhǎng)并且對(duì)維持食醋酸度具有重要作用[18]，因而永春老醋發(fā)酵和前期貯存過程中存在相對(duì)豐度低于變形菌門的厚壁菌門細(xì)菌群落。

圖2 門水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個(gè)階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在綱水平下，永春老醋在發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中共檢測(cè)出4類細(xì)菌物種。相對(duì)豐度>1%的物種如圖3所示，3個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌綱分別是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和芽孢桿菌綱 (Bacilli)，α-變形菌綱的相對(duì)豐度分別為67.41%、68.25%和75.04%，芽孢桿菌綱的相對(duì)豐度分別為32.53%、31.51%和24.85%。3個(gè)階段中α-變形菌綱的相對(duì)豐度與變形菌門的相對(duì)豐度非常接近，說明3個(gè)階段細(xì)菌物種在變形菌門水平下主要為α-變形菌綱，同時(shí)包含少量其他物種；芽孢桿菌綱的相對(duì)豐度與厚壁菌門的相對(duì)豐度完全一致，說明細(xì)菌物種在厚壁菌門水平下均為芽孢桿菌綱。α-變形菌綱菌群多為專性好氧菌，是食醋釀造中將糖類和醇類物質(zhì)氧化為有機(jī)酸的主要微生物[19]；芽孢桿菌綱菌群為兼性厭氧菌，這類微生物含有的特殊酶系能夠?qū)⒋蠓肿犹穷愇镔|(zhì)和蛋白質(zhì)分解為葡萄糖和簡(jiǎn)單肽段，為α-變形菌綱菌群提供可利用的有機(jī)物質(zhì)。

圖3 綱水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個(gè)階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

在屬水平下，永春老醋前3個(gè)階段樣品一共檢測(cè)出13類細(xì)菌物種。圖4顯示的是豐度水平前2的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種分別是相對(duì)豐度為66.58%的醋酸桿菌屬(Acetobacter)和31.74%的乳桿菌屬(Lactobacillus)，在1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中醋酸桿菌屬相對(duì)豐度分別為68.21%和74.84%，乳桿菌屬相對(duì)豐度分別為30.88%和24.72%。3個(gè)階段中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌醋酸菌屬是一類好氧微生物[20]，氧化生成的醋酸是食醋中有機(jī)酸的主要成分，因此食醋發(fā)酵階段主要添加醋酸菌；在1年陳釀(Y3)中醋酸菌屬豐度達(dá)到最高，可能是發(fā)酵結(jié)束后食醋中存在充足的氧氣和有機(jī)物質(zhì)，更利于這類微生物生長(zhǎng)；乳酸菌屬為兼性厭氧菌，在低氧環(huán)境下仍能快速生長(zhǎng)繁殖，所以發(fā)酵過程中乳酸菌屬的相對(duì)豐度要高于成品貯存階段。乳酸菌是調(diào)和食醋終產(chǎn)品風(fēng)味的重要組成部分，可能來源于醋醅中。此外乳酸菌還具有蛋白質(zhì)分解酶，把蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸，但酶活相比其他微生物則較弱，需要更長(zhǎng)時(shí)間來分解蛋白質(zhì)[21]，乳酸菌的存在可增加食醋中多種有機(jī)酸和胞外多糖等功能性成分的含量，提高食醋風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[22]。從永春老醋前3個(gè)階段乳酸菌屬和醋酸菌屬各自所占比例來看，3個(gè)階段中2個(gè)菌屬都以接近1∶3的比例共存，可能是形成永春老醋獨(dú)特風(fēng)味的重要原因。

圖4 屬水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)3個(gè)階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)組成

在門水平下，4個(gè)階段永春老醋樣品中共有7類真菌物種。圖5顯示的是相對(duì)豐度水平>1%的優(yōu)勢(shì)物種，子囊菌門(Ascomycota)皆為4個(gè)階段永春老醋的優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度分別為98.90%、99.98%、99.96%和97.12%，說明其對(duì)永春老醋不同階段風(fēng)味和品質(zhì)的形成皆起著重要作用；發(fā)酵中(Y1)和10年陳釀(Y4)還檢測(cè)到相對(duì)豐度分別為1.03%和1.01%的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，說明擔(dān)子菌門對(duì)食醋的發(fā)酵和后期貯存過程中風(fēng)味和品質(zhì)的形成也具有一定作用；此外，10年陳釀(Y4)中還存在1.72%為分類不明的真菌(norank_k_Fungi)。

圖5 門水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個(gè)階段真菌群落結(jié)構(gòu)

在綱水平下，4個(gè)階段的永春老醋樣品共有13類真菌物種，圖6顯示的是相對(duì)豐度水平前3的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品的優(yōu)勢(shì)菌綱為酵母綱(Saccharomycetes)，相對(duì)豐度分別達(dá)到96.84%、98.85%和98.93%，其次是散囊菌綱(Eurotiomycetes)，相對(duì)豐度分別為1.80%、1.09%和0.98%；10年陳釀(Y4)的優(yōu)勢(shì)菌綱為散囊菌綱，相對(duì)豐度為50.36%，酵母菌綱相對(duì)豐度只占46.43%。以上說明，發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品的優(yōu)勢(shì)菌群除了相對(duì)豐度略顯差異外，其群落結(jié)構(gòu)組成較為相近；10年陳釀(Y4)中優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)組成和比例均與前3個(gè)階段存在明顯差異。原因可能是由于永春老醋在生產(chǎn)和前期貯存過程中存在充足的糖類物質(zhì)供酵母類菌群降解為乙醇和CO2，所以酵母類菌群能夠大量存活；而貯存10年后的老醋隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，食醋中有機(jī)物質(zhì)含量下降，水分活度降低，滲透壓升高，優(yōu)勢(shì)菌群由酵母菌綱轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谠诘退只疃群透邼B透壓環(huán)境中生長(zhǎng)的散囊菌綱。

圖6 綱水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個(gè)階段真菌群落結(jié)構(gòu)

在屬水平下，4個(gè)階段永春老醋樣品共有17個(gè)真菌物種，圖7顯示的是相對(duì)豐度水平前5的物種，其他物種合并為others。發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群均為酵母目未分類屬(unclassified_o_Saccharomycetales)，相對(duì)豐度分別為96.37%、98.80%和98.73%。酵母菌是食醋釀造過程中主要功能微生物，發(fā)酵過程中的酵母菌大部分源于醋醅，酵母菌不僅能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙醇，而且能代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味成分，例如生香釀酒酵母、假絲酵母和產(chǎn)酯的畢赤酵母等[23]。10年陳釀(Y4)中真菌群落的組成和比例發(fā)生一定變化，優(yōu)勢(shì)菌群主要由相對(duì)豐度為50.36%的發(fā)菌科未分類屬(unclassified_f_Trichocomaceae)、28.07%的酵母目分類不明屬(norank_o_Saccharomycetales)以及17.68%的畢赤酵母屬(Pichia)組成。永春老醋在發(fā)酵和前期貯存中存在充足的糖類有機(jī)物質(zhì)，非常適于酵母菌屬菌群生長(zhǎng)，所以酵母菌屬在永春老醋發(fā)酵階段和成品前期貯存中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；10年陳釀中酵母菌屬比例明顯減少，可能是由于老醋在長(zhǎng)期貯存中糖類物質(zhì)含量降低，使得酵母菌屬生長(zhǎng)被抑制。10年陳釀(Y4)中存在了一定比例的畢赤酵母屬，畢赤酵母是食醋發(fā)酵中常見的產(chǎn)香酵母，具有增加食醋香味的作用[24]。這類微生物在低pH、高滲透壓等不利環(huán)境下適應(yīng)能力較強(qiáng)[25]。

圖7 屬水平下永春老醋發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)、1年陳釀(Y3)和10年陳釀(Y4)4個(gè)階段真菌群落結(jié)構(gòu)

2.4 β-多樣性分析

層級(jí)聚類分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度反映在層級(jí)聚類樹圖上，如果樣品間物種組成越相似，在層級(jí)聚類樹圖中距離數(shù)值就越接近。如圖8-a所示，3組樣品間都相差一定距離，說明發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)樣品細(xì)菌群落都有一定差異。其中，1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)優(yōu)先聚類，二者的距離為0.101 6，細(xì)菌群落差異程度較?。话l(fā)酵中(Y1)與1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的距離分別為0.269 0和0.267 7，說明發(fā)酵中(Y1)與2個(gè)成品細(xì)菌群落的差異程度較大。由圖8-b可知，除10年陳釀(Y4)外，前3個(gè)階段樣品優(yōu)先聚類，1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)距離最短，幾乎沒有差異，說明兩者真菌群落相似性很高；發(fā)酵中(Y1)樣品與1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)的距離分別為0.024 9和0.023 8，說明發(fā)酵中Y1樣品與2個(gè)成品的真菌群落組成也較為相近；前3個(gè)階段樣品與10年陳釀(Y4)的距離分別為0.973 9、0.984 3和0.983 6，說明前3個(gè)階段樣品與10年陳釀(Y4)真菌群落之間差異非常明顯。綜上可知，發(fā)酵中(Y1)、1個(gè)月成品(Y2)和1年陳釀(Y3)之間的細(xì)菌群落相似性要低于真菌群落，說明永春老醋在發(fā)酵和產(chǎn)品前期貯存過程中，醋液中細(xì)菌群落的變化大于真菌群落。

a-OTU水平下細(xì)菌層級(jí)聚類樹;b-OTU水平下真菌層級(jí)聚類樹

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)形成永春老醋品質(zhì)的微生物多樣性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明了永春老醋發(fā)酵中、1個(gè)月成品、1年陳釀和10年陳釀4個(gè)階段主要的優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)含量和組成均有所不同，說明了不同階段不同微生物對(duì)老醋品質(zhì)的形成可能起著不同的作用。豐度(Chao)和多樣性(Shannon)指數(shù)分析顯示，發(fā)酵中、1個(gè)月成品和1年陳釀?dòng)来豪洗字屑?xì)菌和真菌的豐富度與多樣性差別較小，且相同時(shí)期下細(xì)菌豐富度與多樣性均顯著高于真菌；10年陳釀?dòng)来豪洗字姓婢S度和多樣性指數(shù)增加明顯。菌群OTU數(shù)量顯示發(fā)酵中、1個(gè)月成品和1年陳釀?dòng)来豪洗准?xì)菌群落組成較為相似，發(fā)酵中和10年陳釀?dòng)来豪洗渍婢郝浣M成較為特殊。永春老醋發(fā)酵過程中和成品前期貯存階段(1個(gè)月和1年)以醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和酵母目未分類屬(unclassified_o_Saccharomycetales)為優(yōu)勢(shì)菌，這3個(gè)階段中乳酸菌代謝產(chǎn)物為醋酸菌和酵母菌提供充足的糖類、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生的醇類和醛類物質(zhì)進(jìn)一步被醋酸菌發(fā)酵生成有機(jī)酸[26-27]。種類不同的乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)時(shí)相互作用不同，某些特殊酵母菌和乳酸菌共培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生愉悅香味，而另一些則會(huì)產(chǎn)生異味[28-29]。這3類優(yōu)勢(shì)菌共同保證了永春老醋發(fā)酵中和成品前期貯存階段的獨(dú)特風(fēng)味和品質(zhì)。隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，10年陳釀?dòng)来豪洗字袃?yōu)勢(shì)菌由發(fā)菌科未分類屬(unclassified_f_Trichocomaceae)、酵母目分類不明屬(norank_o_Saccharomycetales)和部分畢赤酵母屬(Pichia)組成，卻無法檢測(cè)到細(xì)菌類微生物。說明經(jīng)過長(zhǎng)期貯存和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，其微生物組成發(fā)生了變化。10年永春老醋由于長(zhǎng)時(shí)間密閉貯存，醋液中含氧量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)急劇下降，已不適合細(xì)菌類微生物在老醋溶液環(huán)境中生存，此時(shí)主要存在維持老醋品質(zhì)的酵母菌和易于低pH和高滲透壓環(huán)境中生長(zhǎng)的發(fā)菌。1個(gè)月成品和1年陳釀2個(gè)階段細(xì)菌群落組成相近，但與發(fā)酵中的樣品存在較大差異；發(fā)酵中、1個(gè)月成品和1年陳釀3個(gè)前期生產(chǎn)和保存階段的永春老醋真菌群落相似度高，皆與10年陳釀?dòng)忻黠@差異，細(xì)菌與真菌群落組成在不同階段的變化趨勢(shì)不同，細(xì)菌在發(fā)酵過程中的變化大于貯存前期，說明細(xì)菌可能在生產(chǎn)前期對(duì)老醋品質(zhì)形成作用較大，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)減小甚至消失，而真菌剛好相反，發(fā)酵過程中和貯存前期(1個(gè)月和1年)的群落組成變化小于長(zhǎng)期貯存的(10年)樣品，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，真菌多樣性提高，可能對(duì)老醋品質(zhì)形成起著重要作用。