花櫚木葉黃酮類(lèi)化合物提取純化工藝優(yōu)化

朱仕豪，凌智輝，張湘龍，唐 其,2，陸 英,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家中藥材生產(chǎn)（湖南）技術(shù)中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410128）

花櫚木（Ormosia henryi Prain）為豆科紅豆屬常綠喬木，又名花梨木、臭桶柴、紅豆樹(shù)等，分布于我國(guó)安徽、浙江、江西、湖南、湖北、廣東、四川、貴州、云南等地[1]?；澳疽愿?、根皮、莖及葉入藥，全年可采，曬干備用或鮮用，主治跌打損傷、腰肌勞損、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后血瘀腹痛、白帶、流行性腮腺炎、絲蟲(chóng)病；根皮外用治骨折，葉外用治燒傷、燙 傷[2]。目前，花櫚木主要作為園林綠化樹(shù)種，同時(shí)因其木材致密質(zhì)重，紋理清晰美麗，多用于制作高檔家具、裝飾品以及文房諸器等，故對(duì)其研究主要集中在育種、施肥等方面[3-6]，而對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用的研究相對(duì)較少，F(xiàn)eng 等[7]從花櫚木根皮中分離得到23 個(gè)化合物，并對(duì)其中的2 個(gè)化合物進(jìn)行了抗氧化活性和抗癌活性研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，花櫚木葉提取物中含有具抗抑郁活性的成分，從中分離鑒定得到8 個(gè)黃酮類(lèi)化合物，采用UPLC- ESI-QTOFMS/MS 技術(shù)初步鑒定出46 種黃酮類(lèi)化合物[8]。為進(jìn)一步提高提取物中黃酮類(lèi)化合物的含量，筆者對(duì)花櫚木葉黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)靜態(tài)吸附和解析對(duì)10 種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了篩選，再通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)對(duì)花櫚木葉總黃酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為花櫚木葉進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試原料花櫚木葉采于湖南省郴州市桂陽(yáng)縣湖南利諾生物藥業(yè)有限公司，60℃烘干后粉碎，過(guò)20 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑有蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，上海源葉生物科技有限公司），無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM130、AB-8、D101、NKA-9、X-5 等10 種大孔吸附樹(shù)脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

主要儀器有粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），101-1AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱、HH-ZK8 電熱恒溫水浴鍋（上海標(biāo)和儀器有限公司），UV-2100 紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法，精密稱(chēng)取干燥至恒重的純度為98%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品8.14 mg，置于10 mL 容量瓶中，用70%的乙醇溶解，然后再加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加70%的乙醇補(bǔ)充至2 mL；加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后放置6 min；然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 mL，搖勻后再放置6 min；再加入5%的NaOH 溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容，搖勻后放置10 min，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，重復(fù)測(cè)定3 次。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程y=12.415x-0.003 5（R2=0.999 6）。花櫚木總黃酮得率（%）=樣品中總黃酮的質(zhì)量（g）/干物料的質(zhì)量（g）×100。

1.2.2 花櫚木葉總黃酮提取工藝優(yōu)化 （1）花櫚木葉總黃酮提取工藝流程：取1.0 g 花櫚木葉原料加入提取溶劑后置水浴鍋中提取一定時(shí)間，趁熱過(guò)濾，定容至50 mL，取樣檢測(cè)。（2）單因素試驗(yàn)。分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、30%、50%、70%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，g/mL）、提 取 溫 度（30、50、70、80、90、100 ℃）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。（3）正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別在每個(gè)因素的最佳值附近選擇3 個(gè)水平，然后進(jìn)行4 因素3 水平的L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

1.2.3 花櫚木葉總黃酮純化工藝優(yōu)化 （1）花櫚木葉總黃酮的制備。取花櫚木葉粉末，按1.2.2 中所得最佳工藝條件進(jìn)行提取，55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)乙醇味，然后用等體積石油醚萃取3 次，分離石油醚層后，取水相在55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去殘留石油醚后測(cè)定總黃酮含量，冷藏備用，使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。（2）樹(shù)脂預(yù)處理。將新購(gòu)的大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇充分浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用蒸餾水洗滌至無(wú)乙醇味，備用。（3）樹(shù)脂篩選。將10 種預(yù)處理好的大孔吸附樹(shù)脂去除表面水分后，各精密稱(chēng)取2.0 g 至于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 濃度為2.14 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液，置于30℃恒溫?fù)u床，100 r/min 條件下振蕩24 h，計(jì)算各型號(hào)樹(shù)脂的吸附量。將充分吸附后的各型號(hào)樹(shù)脂用少量蒸餾水沖洗，除去表面水分后，加入50 mL 70%的乙醇溶液，置于30℃恒溫?fù)u床，100 r/min 條件下振蕩解吸24 h，計(jì)算解析量。根據(jù)吸附量和解吸量，選擇最合適的樹(shù)脂。（4）上樣液濃度的確定。取濃度分別為0.43、0.86、1.29、1.71、2.14 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液各150 mL，以3 BV/h 的流速分別通過(guò)裝有50 mL AB-8 樹(shù)脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，對(duì)其中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最佳上樣液濃度。（5）上樣液pH 值的確定。取150 mL 濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液5 份，分別用冰乙酸或者NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至2、3、4、5 和6，以3 BV/h 的流速分別通過(guò)裝有50 mL AB-8 樹(shù)脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，對(duì)其中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最佳上樣液pH 值。（6）上柱流速的確定。取150 mL 濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液5 份，將pH 值調(diào)節(jié)至3，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速通過(guò)裝有50 mL AB-8 樹(shù)脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，對(duì)其中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最佳上柱流速。（7）上柱體積的確定。將pH 值為3，濃度為1.71 mg/mL 的花櫚木葉總黃酮原料液，以4 BV/h 的流速通過(guò)裝有50 mL AB-8 樹(shù)脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，每50 mL 為一個(gè)流分，共收集16 個(gè)流分，對(duì)其中的總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，確定最佳的上柱體積。（8）洗脫劑濃度的確定。取AB-8 大孔吸附樹(shù)脂5 份，每份50 mL，按上述得到的最佳條件進(jìn)行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質(zhì)，用5 BV 體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)總黃酮含量，篩選出最佳洗脫劑濃度。（9）洗脫流速的確定。取AB-8 大孔吸附樹(shù)脂5份，每份50 mL，按上述得到的最佳條件進(jìn)行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質(zhì)，分別用5 BV 體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)總黃酮含量，篩選出最佳洗脫流速。（10）洗脫體積的確定。取AB-8 大孔吸附樹(shù)脂50 mL，按上述得到的最佳條件進(jìn)行上樣吸附，上樣完畢后靜置30 min，用150 mL 蒸餾水洗去雜質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脫，每50 mL 收集一份洗脫液，檢測(cè)總黃酮含量，篩選出最佳洗脫體積。（11）純化效果驗(yàn)證。按上述所得最佳純化工藝進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)，將洗脫液濃縮后冷凍干燥得花櫚木葉總黃酮純化產(chǎn)品，測(cè)定其總黃酮含量，以驗(yàn)證優(yōu)化后工藝條件的純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 花櫚木葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 如圖1 所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶40（g/mL）、提取溫度80℃、提取時(shí)間1.0 h條件下，各單因素試驗(yàn)的總黃酮得率最高，以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)表1 的正交試驗(yàn)方案。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

圖1 不同提取因素對(duì)花櫚木葉黃酮得率的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 如表2 所示，從K 值可以看出，各因素不同水平對(duì)花櫚木葉總黃酮化合物浸出的影響大小為A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C1＞C3＞ C2、D3＞D2＞D1。從極差（R）值可以看出，不同因素對(duì)花櫚木葉總黃酮化合物浸出的影響大小為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度。綜合以上條件，確定花櫚木葉總黃酮的最佳提取工藝為A1B2C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取溫度80℃，提取時(shí)間1.5 h。

由于最佳提取工藝組合未在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9 個(gè)組合中，因此需要對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)5 次，花櫚木葉總黃酮得率分別為2.81%、2.82%、2.85%、2.85%、2.84%，平均值為2.83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD 值）為0.73%，高于其他試驗(yàn)結(jié)果，表明正交試驗(yàn)獲得的最佳工藝組合是有效且可靠的。對(duì)該工藝制備得到的花櫚木葉提取物經(jīng)溶劑回收，冷凍干燥成粉末，測(cè)得提取物中總黃酮含量為15.95%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 花櫚木葉總黃酮純化工藝優(yōu)化

2.2.1 樹(shù)脂篩選 試驗(yàn)考察了10 種大孔吸附樹(shù)脂的吸附/解吸性能，從表3 可以看出，HPD-100、HPD-400、AB-8、X-5 這4 種樹(shù)脂都具有很好的吸附性能，吸附量均大于41 mg/g，這4 種樹(shù)脂中AB-8 樹(shù)脂的解吸量和解吸率均較高，最終選擇AB-8 大孔吸附樹(shù)脂純化花櫚木葉總黃酮。

表3 10 種大孔吸附樹(shù)脂的吸附/解吸性能

2.2.2 上樣液濃度對(duì)總黃酮吸附率的影響 由圖2 可知，隨著上樣液濃度增加，吸附率不斷增大，是因?yàn)殡S著濃度增加，分子越來(lái)越密集，與樹(shù)脂接觸并被吸附的概率越大；當(dāng)上樣液濃度為1.71 mg/mL 時(shí)，吸附率為87.54%，達(dá)到最高；而繼續(xù)增加上樣液濃度，吸附率開(kāi)始下降，是因?yàn)闈舛冗^(guò)大，上樣液中的黃酮類(lèi)物質(zhì)還未被充分吸附即被濾出，導(dǎo)致吸附率降低。因此最佳上樣液濃度為1.71 mg/mL。

圖2 不同上樣液濃度處理總黃酮的吸附率

2.2.3 上樣液pH 值對(duì)總黃酮吸附率的影響 由圖3可知，隨著pH 值不斷增大，吸附率呈下降趨勢(shì)。黃酮類(lèi)化合物因含有多個(gè)酚羥基而呈弱酸性，因而在酸性或者弱酸性條件下更容易與樹(shù)脂產(chǎn)生氫鍵，從而被吸附。隨著pH 值不斷增大，黃酮類(lèi)化合物容易轉(zhuǎn)變成鹽，因而不容易被樹(shù)脂吸附，導(dǎo)致吸附率下降。由于pH 值為3 和pH 值為2 時(shí)的吸附率相差甚微，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇將上樣液的pH 值調(diào)為3。

圖3 不同上樣液pH 值處理總黃酮的吸附率

2.2.4 上樣流速對(duì)總黃酮吸附率的影響 由圖4可知，隨著流速加快，吸附率越來(lái)越低。因?yàn)榱魉僭铰蠘右毫鬟^(guò)樹(shù)脂的時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)與樹(shù)脂接觸更充分，從而更容易被吸附。流速為4 BV/h 與流速為1 BV/h 的吸附率相差不到1%，為了提高純化效率，選擇4 BV/h 的流速上樣。

圖4 不同上樣流速處理總黃酮的吸附率

2.2.5 上樣體積對(duì)總黃酮吸附率的影響 由圖5可知，隨著上樣體積增加，流出液中泄漏出來(lái)的總黃酮量越來(lái)越大，當(dāng)上樣體積為5 BV 時(shí)，流出液中總黃酮濃度為0.18 mg/mL，稍大于上樣液濃度（1.71 mg/mL）的10%；當(dāng)上樣體積達(dá)到13 BV 時(shí)，流出液中總黃酮濃度基本與上樣液濃度持平，說(shuō)明達(dá)到吸附飽和?？紤]到效率和效益，最終選擇上樣體積為5 BV。

圖5 不同上樣體積處理流出液總黃酮的濃度

2.2.6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，解吸率越來(lái)越高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%之后，再增大乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率影響不大，為了節(jié)約成本，最終選擇體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液作為洗脫劑。

圖6 不同洗脫劑體積分?jǐn)?shù)處理總黃酮的解吸率

2.2.7 洗脫流速對(duì)解吸率的影響 由圖7 可知，隨著洗脫流速的加快，解吸率越來(lái)越低。洗脫流速過(guò)快，洗脫劑還未充分解吸樹(shù)脂上吸附的黃酮就已經(jīng)流出柱外，導(dǎo)致解吸率低；流速太慢，雖然能充分解吸，但是 周期過(guò)長(zhǎng)，洗脫流速為3 BV/h 與流速為1 BV/h 的解吸率相差甚微，為提高效率，確定洗脫流速為3 BV/h。

圖7 不同洗脫流速處理總黃酮的解吸率

2.2.8 洗脫液體積對(duì)解吸率的影響 由圖8 可知，當(dāng)洗脫液體積為4 BV 時(shí)，洗脫液中的總黃酮濃度已經(jīng)降至很低，說(shuō)明此時(shí)樹(shù)脂所吸附的黃酮已基本洗脫完全，繼續(xù)洗脫成本增加而得率不高，還不利于溶液的濃縮，因此確定洗脫體積為4 BV。

2.2.9 純化效果驗(yàn)證 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，總黃酮最佳純化工藝參數(shù)如下：采用AB-8 大孔吸附樹(shù)脂，上樣液濃度1.71 mg/mL、上樣液pH 值=3，以4 BV/h流速上樣，上樣體積5 BV 進(jìn)行吸附，然后以80%的乙醇溶液按3 BV/h 的流速洗脫，洗脫體積為4 BV。按最佳純化工藝條件重復(fù)試驗(yàn)5 次，將洗脫液濃縮后冷凍干燥成粉末，測(cè)得粉末中總黃酮含量分別為29.94%、28.91%、29.63%、30.24%、28.85%，平均值為29.51%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD 值）為2.09%。這表明經(jīng)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂純化后，花櫚木葉提取物中總黃酮含量提高了約1 倍，實(shí)現(xiàn)了成分的富集。

圖8 不同洗脫體積處理流出液總黃酮的濃度

3 結(jié) 論

研究利用正交試驗(yàn)得到回流提取法提取花櫚木葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取溫度80 ℃，提取時(shí)間1.5 h。在此條件下，花櫚木葉總黃酮得率為2.83%，將提取液冷凍干燥成粉末后，測(cè)得其總黃酮含量為15.95%。

通過(guò)比較10 種不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂的吸附率和解吸率，發(fā)現(xiàn)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花櫚木葉總黃酮有良好的吸附與解吸性能，其最佳純化工藝參數(shù)為上樣液濃度1.71 mg/mL，上樣液pH 值3，上樣流速4 BV/h，上樣體積5 BV，洗脫液為體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，洗脫流速3 BV/h，洗脫體積4 BV。經(jīng)純化后，花櫚木葉提取物粉末中總黃酮含量由原來(lái)的15.95%提高至29.51%。