豬糞有機(jī)肥中可溶性有機(jī)組分對小白菜生長及Cu吸收的影響

黃興潔，吳 昊，李婉秋，李戀卿，潘根興

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所，江蘇 南京 210095)

長期畜禽糞便農(nóng)用以及以畜禽糞便為原料的有機(jī)肥農(nóng)用已成為我國農(nóng)田土壤重金屬的重要來源[1]。有機(jī)肥中含有大量可溶性有機(jī)質(zhì)(dissolved organic matter，DOM)，作為有機(jī)質(zhì)中最活躍的組成部分，豐富的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)使其具有很強(qiáng)的表面絡(luò)合能力，其與重金屬絡(luò)合或螯合后可改變土壤中金屬離子的行為和有效性[2]。曾希柏等[3]的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤中有效Cu含量及小油菜植株Cu含量均呈現(xiàn)隨DOM添加量增加而增加的趨勢。而HU等[4]的批量平衡試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)平衡溶液中ρ(Cu2+)低于2.81 mg·L-1時，從玉米秸稈中提取的新鮮DOM可促進(jìn)黃壤對Cu的吸附，而新鮮DOM在好氧條件下培養(yǎng)30 d后卻對Cu的吸附顯示出抑制效應(yīng)。這種變化可能是因?yàn)镈OM是由較高分子質(zhì)量的胡敏酸、富里酸以及低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、糖類和其他化合物組成的有機(jī)混合物[5]，不同的組分、官能團(tuán)種類和數(shù)量以及分子質(zhì)量組成等均會對其絡(luò)合或螯合效應(yīng)產(chǎn)生影響[6]。DOM分子質(zhì)量是控制重金屬生物有效性、毒性和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素之一。研究表明，在水生生態(tài)系統(tǒng)中，高分子質(zhì)量DOM比低分子質(zhì)量DOM更能降低Cu對大水蚤的毒性[7]。但關(guān)于不同分子質(zhì)量DOM對植物生長和重金屬吸收影響的研究還較少。

筆者采用平衡透析法將豬糞中提取的DOM分離為不同分子質(zhì)量組分，通過砂培試驗(yàn)研究不同分子質(zhì)量和濃度梯度DOM對小白菜生長及Cu吸收的影響，以期為有機(jī)肥還田的環(huán)境風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試豬糞采自山西省岢嵐縣集約化養(yǎng)殖場，在豬糞中按照豬糞與秸稈干重比為10∶1的比例添加小麥秸稈后堆肥腐熟1個月，風(fēng)干、磨細(xì)后過2 mm孔徑篩備用。石英砂用w=2%的稀HNO3浸泡24 h，用自來水反復(fù)沖洗以洗凈殘酸(洗脫溶液pH呈中性)，再用去離子水洗2～3次，風(fēng)干備用。

1.2 DOM的提取與分子質(zhì)量分組

取部分腐熟的豬糞樣品于250 mL塑料瓶中，按m(物料)∶V(水)=1∶10加入超純水，于25 ℃、200 r·min-1條件下在水平恒溫振蕩機(jī)上振蕩16 h，離心30 min(轉(zhuǎn)速為4 500 r·min-1，離心半徑為10 cm)，上清液立即用0.45 μm無菌微孔濾膜抽氣過濾，將樣液存放于4 ℃冰箱中待用，存放時間不超過1周。用TOC儀測得的豬糞有機(jī)肥中DOM質(zhì)量含量為62.06 g·kg-1。

DOM分子質(zhì)量組分的分離采用平衡透析法[8]，選取截留分子質(zhì)量為1和14 kDa兩種型號生物透析袋。透析前，先將透析袋剪切成能裝20 mL溶液的小段，在超純水中浸泡過夜以去除殘留的有機(jī)聚合物，并反復(fù)清洗供試驗(yàn)用。以500 mL玻璃燒杯作為透析容器，加入400 mL超純水作為外部溶液，先將截留分子質(zhì)量為1 kDa的透析袋一端用塑料夾子密封(確保不漏液)，加入20 mL制備好的DOM溶液，再將透析袋的另一端用塑料夾子密封，將裝好DOM溶液的透析袋完全浸沒在水中，最后用保鮮膜密封燒杯口，防止在試驗(yàn)過程中燒杯內(nèi)水分蒸發(fā)。在恒溫4 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行透析，試驗(yàn)過程中經(jīng)常用玻璃棒在燒杯中攪拌，20 h后更換一次外部溶液，繼續(xù)透析20 h，整個透析過程持續(xù)40 h。此次透析完成后，透析袋外的溶液即為分子質(zhì)量小于1 kDa的成分，然后將透析袋內(nèi)剩余樣品轉(zhuǎn)移到截留分子質(zhì)量為14 kDa的透析袋中進(jìn)行第2次透析。透析完成后，得到F1(<1 kDa)、F2(1～14 kDa)和F3(>14 kDa)3個分子質(zhì)量組分的DOM溶液樣品，用TOC分析儀測得其質(zhì)量濃度(以C計(jì))分別為90.48、19.84和56.49 mg·L-1，溶液中ρ(Cu)分別為0.23、0.28和0.17 mg·L-1。

1.3 砂培試驗(yàn)

共設(shè)置DOM和DOM-Cu兩組溶液處理。DOM處理中包括F1、F2和F3這3個分子質(zhì)量組分，每個組分設(shè)置5、10和20 mg·L-1這3個DOM濃度水平，分別標(biāo)記為F11、F12、F13，F(xiàn)21、F22、F23以及 F31、F32、F33，并以超純水作為對照；DOM-Cu處理為F1、F2和F3這3個分子質(zhì)量組分的DOM在5、10和20 mg·L-1這3個濃度水平下與2.5 mg·L-1CuSO4的混合溶液處理，分別標(biāo)記為F11、F12、F13，F(xiàn)21、F22、F23以及F31、F32、F33，并以2.5 mg·L-1CuSO4溶液作為對照。采用Cu離子選擇電極測定各處理液中Cu絡(luò)合率[9]，在磁力攪拌下將銅電極和參比電極插入標(biāo)準(zhǔn)Cu溶液體系(10-6～10-2mol·L-1)中，由低濃度到高濃度分別測定平衡電位值，并以電位值對銅離子濃度的負(fù)對數(shù)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各DOM-Cu處理液相應(yīng)平衡電位值條件下的離子態(tài)Cu濃度，進(jìn)而計(jì)算得到Cu有機(jī)絡(luò)合率。各處理液性質(zhì)見表1。

盆栽試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行，供試小白菜品種為“矮腳黃”，將矮腳黃種子在w=10%的過氧化氫溶液中消毒10 min，然后用超純水洗凈。培養(yǎng)皿中放入一層濾紙，將消毒好的種子均勻放在濾紙上，加少許超純水，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下催芽48 h。將發(fā)芽后種子播種于裝有300 g石英砂的60 mm×80 mm的塑料盆中，3～4 d后開始供應(yīng)pH=5.8的1/4 Hoagland營養(yǎng)液，7 d后改為1/2營養(yǎng)液，Hoagland 營養(yǎng)液各成分濃度(mmol·L-1)為NH4H2PO4，1；KNO3，1.5；Ca(NO3)2·4H2O，1；MgSO4·7H2O，1；H3BO3，0.046；MnCl2·4H2O，0.009；CuSO4·5H2O，0.000 3；ZnSO4·7H2O，0.000 8；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.000 1；Fe-EDTA，0.044。

表1 不同分子質(zhì)量DOM含量和Cu絡(luò)合率

生長15 d后，每盆留下長勢相近的小苗8株，開始添加不同處理液，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。為避免DOM添加后快速分解，各處理溶液每周添加2次，每次每盆添加30 mL，持續(xù)3周后收獲小白菜。在不破壞根系的情況下將收獲的小白菜分為根和地上部，先用自來水沖洗多次，再用超純水沖洗3次，并用根系掃描儀(Epson Expression 10000XL，Japan)測定根長和根尖數(shù)。鮮樣在105 ℃條件下殺青30 min后，于70 ℃烘箱中烘干至恒重，分別稱量小白菜根和地上部干重后粉碎待測。

測定方法：稱取適量樣品用V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1的混合酸消解完全，待測溶液定容、過濾后用火焰原子吸收分光光譜儀測定(FAAS，北京普析，TAS986)，以灌木枝葉GBW07603(GSV-2)進(jìn)行質(zhì)量控制，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率在87%～113%之間。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD多重比較檢驗(yàn)和Duncan氏新復(fù)極差法分析不同處理間差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOM對小白菜生長的影響

不同分子質(zhì)量DOM和DOM-Cu對小白菜產(chǎn)量的影響見圖1，各處理小白菜地上部分干重在0.43～0.51 g·盆-1之間，DOM和DOM-Cu各處理對小白菜產(chǎn)量無顯著影響。從小白菜總根長(圖2)來看，DOM處理總根長為85～119 cm，添加不同分子質(zhì)量、不同濃度DOM處理總根長比超純水處理顯著增加19%～40%，但不同DOM處理間無顯著差異；與僅添加CuSO4溶液相比，DOM-Cu處理F12和F23總根長顯著增加17%和15%，而其他處理與之差異不顯著。在相同分子質(zhì)量和濃度DOM組中，與DOM處理相比，DOM-Cu處理根長降低4%～15%。

對根尖數(shù)的影響與根長類似(圖2)，與超純水處理相比，DOM處理小白菜根尖數(shù)均顯著增加，且增幅高達(dá)45%～91%。與CuSO4溶液處理相比，DOM-Cu處理根尖數(shù)減少2%～29%，F(xiàn)21、F22、F31、F32和F33差異達(dá)顯著水平。在相同分子質(zhì)量和濃度DOM組中，DOM-Cu處理根尖數(shù)比DOM處理顯著降低44%～60%。

2.2 DOM對Cu生物有效性的影響

圖3顯示，與CK相比，DOM各處理小白菜根系Cu含量均表現(xiàn)出不同程度的升高，增幅為0.2%～53%。在添加相同分子質(zhì)量組分的DOM處理中，高濃度DOM更能促進(jìn)小白菜根系對Cu的吸收，其中，F(xiàn)1、F2和F3這3個組分在添加濃度為20 mg·L-1時根系w(Cu)分別為157.48、153.40和171.15 mg·kg-1，比CK分別顯著提高41%、37%和53%。

小白菜地上部Cu含量低于根系(圖3)，F(xiàn)2組分各濃度處理小白菜地上部Cu含量均顯著提高，隨著DOM濃度的升高，地上部Cu含量較CK分別提高40%、66%和74%。F1組分中，僅F13處理小白菜地上部Cu含量較CK顯著提高，且增幅高達(dá)89%。F3處理小白菜地上部Cu含量呈現(xiàn)隨DOM添加濃度的增加而逐漸降低的趨勢，當(dāng)DOM添加濃度為5 mg·L-1時(F31)，小白菜地上部Cu含量比CK顯著提高50%，而F32、F33處理增幅僅分別為13%和2%。

不同處理小白菜植株對Cu的總吸收量見圖3。除F11處理外，添加DOM的其余各處理小白菜植株對Cu的總吸收量比CK提高10%～75%。F1和F2組分中，小白菜對Cu的總吸收量隨著DOM添加濃度的提高而遞增，F(xiàn)13處理較CK顯著提高75%，F(xiàn)21、F22和F23較CK分別顯著提高34%、41%和66%；而在F3組分中則呈現(xiàn)相反趨勢，小白菜對Cu的總吸收量隨著DOM添加濃度的提高而遞減，但F31和F32仍比CK顯著提高45%和33%，而各添加濃度間無顯著差異。

2.3 DOM對不同分子質(zhì)量組分小白菜Cu轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

DOM對小白菜Cu轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響與DOM添加濃度和分子質(zhì)量有關(guān)。圖4顯示，F(xiàn)13和F23轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)比對照顯著提高36%和46%，F(xiàn)33比對照低26%。從分子質(zhì)量來看，F(xiàn)1、F2組分表現(xiàn)為促進(jìn)Cu轉(zhuǎn)運(yùn)的趨勢，而F3組分則表現(xiàn)為抑制Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)。F1處理中，F(xiàn)13轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)比對照顯著提高36%，而F11和F12之間沒有顯著差異；F2處理中，F(xiàn)22和F23轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)較CK分別顯著提高48%和46%；F3處理轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)隨DOM濃度的增加而降低，與F13、F23相比，F(xiàn)33處理顯著抑制Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討論

筆者研究結(jié)果表明，不同分子質(zhì)量DOM處理小白菜根長和根尖數(shù)均大于超純水處理，說明DOM可刺激小白菜根系的生長，這與唐超等[10]關(guān)于蚓糞DOM對黑麥草根系生長影響的研究結(jié)果類似，可能是因?yàn)镈OM是由多種可溶性有機(jī)物質(zhì)組成的混合體，其中低分子質(zhì)量氨基酸可以作為營養(yǎng)物質(zhì)直接被植物吸收，而有機(jī)酸本身就是活性物質(zhì)，可促進(jìn)植物生長；而DOM-Cu處理小白菜根長、根尖數(shù)比相同分子質(zhì)量和濃度的DOM處理低，說明植物根系對重金屬等環(huán)境因子反應(yīng)非常敏感，許多研究表明植物根系在重金屬脅迫下根長、根尖數(shù)、根體積和平均根直徑等根形態(tài)指標(biāo)受到明顯抑制[11]。MARQUES等[12]認(rèn)為在重金屬脅迫下根系生長減緩可能是由于細(xì)胞分裂減少，導(dǎo)致根系細(xì)胞壁厚度增加。CHEN等[11]將毛竹置于含100 mmol·L-1Cu溶液中發(fā)現(xiàn)毛竹根系細(xì)胞壁更不規(guī)則，更厚，細(xì)胞核和線粒體出現(xiàn)扭曲。DOM和DOM-Cu處理小白菜產(chǎn)量沒有明顯變化，LI等[13]的研究結(jié)果也表明將商品有機(jī)肥、牛糞和雞糞中提取的DOM添加到土壤中對小白菜地上部生物量沒有顯著影響。

筆者研究結(jié)果還表明不同分子質(zhì)量DOM對小白菜根系吸收Cu均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，且高濃度DOM更能促進(jìn)小白菜根系對Cu的吸收。已有研究報道，添加外源小分子有機(jī)酸、DOM和合成螯合劑均可促進(jìn)植物根系吸收重金屬，這可能與有機(jī)-重金屬復(fù)合物的形成增強(qiáng)了介質(zhì)中重金屬的遷移有關(guān)[13-14]。于振亞等[15]對不同分子質(zhì)量DOM與Cu的絡(luò)合特性的研究結(jié)果表明<1 kDa的DOM組分與Cu2+絡(luò)合的條件穩(wěn)定常數(shù)最大，其絡(luò)合作用最強(qiáng)。加入不同分子質(zhì)量DOM后Cu的形態(tài)分布結(jié)果(表1)與此類似，<1 kDa的DOM組分中73.11%～94.69%的Cu以有機(jī)絡(luò)合態(tài)形式存在，而>14 kDa的DOM組分中有機(jī)絡(luò)合態(tài)Cu僅占39.48%～60.43%。已有研究結(jié)果表明Cu更傾向于與腐殖類物質(zhì)結(jié)合而非類蛋白物質(zhì)[16]。XU等[17]通過三維熒光-平行因子方法分析湖底沉積物中提取的DOM，發(fā)現(xiàn)類腐殖酸和類富里酸熒光基團(tuán)主要存在于低分子質(zhì)量DOM中，而類蛋白質(zhì)熒光基團(tuán)主要存在于高分子質(zhì)量DOM中。因此，不同分子質(zhì)量DOM組分物質(zhì)組成的差異可能導(dǎo)致其與Cu絡(luò)合特性的不同。一般情況下，游離態(tài)金屬離子易于穿過生物膜，認(rèn)為其是最易被植物吸收的形態(tài)，而絡(luò)合態(tài)金屬由于分子質(zhì)量較大、缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白致使其直接進(jìn)入植物細(xì)胞比較困難[18]。但NIU等[19]研究表明Cu-EDDS( [S, S′]-ethylene diamine disuccinic acid, EDDS)絡(luò)合物可以通過根皮層運(yùn)輸?shù)街兄?，特別是在根尖或側(cè)根區(qū)，說明金屬絡(luò)合物有被植物根系直接吸收的可能。筆者研究中高濃度DOM處理均促進(jìn)小白菜根系對Cu吸收的結(jié)果說明DOM-Cu絡(luò)合物有可能直接被小白菜根系吸收。

從小白菜地上部Cu含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來看，1～14 kDa的DOM組分和高濃度<1 kDa的DOM組分促進(jìn)了Cu從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)DOM增加了小白菜根系中Pb向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，且小白菜Pb轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)與DOM的來源和添加濃度有關(guān)。合成螯合劑和小分子質(zhì)量有機(jī)酸方面的研究結(jié)果也顯示有機(jī)配體促進(jìn)了重金屬在植物體內(nèi)的運(yùn)移。ALMAROAI等[14]向污染盆栽土壤中添加不同劑量合成螯合劑(EDTA、EDDS和NTA)和小分子質(zhì)量有機(jī)酸(草酸、檸檬酸)，結(jié)果顯示合成螯合劑和檸檬酸的添加促進(jìn)了玉米根系中Cu和Cr向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)；水培條件下添加EDTA、HEDTA和DTPA等螯合劑以及檸檬酸、蘋果酸和草酸等有機(jī)酸均促進(jìn)了水稻幼苗根系中Cu和Zn向莖葉的轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。ZHAO等[21]通過水培試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黑麥草根系和地上部植株中Cu-EDDS結(jié)合態(tài)含量分別占49%～51%和64%～67%，地上部含量高于根系，這說明EDDS對于Cu從黑麥草根系到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要作用。因此，重金屬通過與有機(jī)物質(zhì)形成穩(wěn)定絡(luò)合物而防止被根細(xì)胞固定，可能是外源有機(jī)配體可提高重金屬向植物地上部轉(zhuǎn)運(yùn)效率的原因之一。筆者研究結(jié)果還顯示與不添加DOM的對照相比，>14 kDa的DOM組分對小白菜Cu轉(zhuǎn)運(yùn)沒有顯著影響，并且轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)呈現(xiàn)隨DOM添加濃度的增大而降低的趨勢，說明>14 kDa的DOM組分抑制了小白菜根系中Cu的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能與不同分子質(zhì)量DOM的組成、性質(zhì)以及其與Cu的絡(luò)合特性不同有關(guān)，這方面的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1)不同分子質(zhì)量的豬糞DOM均增加了小白菜根系的總根長和根尖數(shù)，但對小白菜產(chǎn)量無顯著影響；在添加相同分子質(zhì)量和濃度的DOM組中，DOM-Cu處理小白菜總根長和根尖數(shù)均低于DOM處理。

(2)F1、F2和F3這3個組分DOM均促進(jìn)小白菜根系對Cu的吸收，且添加濃度為20 mg·L-1時的促進(jìn)作用最明顯。對小白菜地上部Cu含量的影響中，F(xiàn)2和F3組分呈現(xiàn)相反趨勢，小白菜地上部Cu含量隨著F2組分添加濃度的升高而增加，而隨F3組分添加濃度的增加而降低，F(xiàn)1組分中僅F13顯著促進(jìn)小白菜地上部Cu含量。

(3)<1和1～14 kDa豬糞DOM組分可促進(jìn)小白菜中Cu從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，而>14 kDa的豬糞DOM組分則抑制Cu從根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)隨著DOM濃度的增加而降低。