LncRNA OCPAT1通過調(diào)控miR-320d/YOD1信號通路促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展

黃曄 賴蔚菁 黃如 劉佳華

[摘要] 目的 研究lncRNA OCPAT1調(diào)控miR-320d/YOD1信號通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。 方法 2019年1月至2020年12月應(yīng)用TCGA和GTEX數(shù)據(jù)庫篩選，通過qRT-PCR檢測確認(rèn)lncRNA AC007405.3（OCPAT1）在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá);在ES-2細(xì)胞中敲減OCPAT1，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，OCPAT1與miR-320d/YOD1的靶向調(diào)控關(guān)系。 結(jié)果 通過GTEX和TCGA數(shù)據(jù)庫及qRT-PCR檢測，確認(rèn)OCPAT1高表達(dá);敲低OCPAT1后，MTT增殖顯示敲減后細(xì)胞增殖減低，EdU細(xì)胞增殖顯示，敲減后處于復(fù)制期的細(xì)胞減少，流式細(xì)胞周期顯示敲減后細(xì)胞停滯在G0/G1期，流式周期顯示敲減后細(xì)胞凋亡增加，Transwell migration實(shí)驗(yàn)顯示，敲減后抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的遷移能力，Matrigel invasion 實(shí)驗(yàn)顯示敲減后抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的侵襲能力。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，OCPAT1可以靶向作用于miR-320d。 結(jié)論 lncRNA OCPAT1可能通過靶向調(diào)控miR-320d/YOD1信號通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] LncRNA OCPAT1;miR-320d/YOD1信號通路;卵巢癌;增殖;遷移;侵襲

[中圖分類號] R737.31? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）33-0041-04

[Abstract] Objective To study the role and mechanism of lncRNA OCPAT1 in regulating the miR-320d/YOD1 signaling pathway in the development and progression of ovarian cancer. Methods From January 2019 to December 2020， the expression of lncRNA AC007405.3 （OCPAT1） in ovarian cancer tissues and cells was confirmed by RT-qPCR using TCGA and GTEX databases screening. OCPAT1 was knocked out in ES-2 cells， and the targeted regulatory relationship between OCPAT1 and miR-320d/YOD1 was verified by experiments. Results High expression of OCPAT1 was confirmed by GTEX and TCGA databases and RT-qPCR detection. After OCPAT1 knockdown， MTT proliferation showed decreased cell proliferation after knockdown. the EdU cell proliferation showed decreased cells in the replication phase after knockdown. flow cytometry cycle showed that cells stagnated in the G0/G1 phase after knockdown; flow cytometry cycle showed increased cell apoptosis after knockdown. The Transwell migration experiment showed that knockout inhibited the migration ability of ovarian cancer cell ES-2， and the Matrigel invasion experiment showed that knockout inhibited the invasion ability of ovarian cancer cell ES-2. Dual luciferase reporter assay confirmed that OCPAT1 could target miR-320d. Conclusion LncRNA OCPAT1 may regulate the proliferation， metastasis and invasion of ovarian cancer cells through the targeted regulation of the mir-320s/YOD1 signaling pathway， thus promoting the occurrence and development of the ovarian cancer.

[Key words] LncRNA OCPAT1; miR-320d/YOD1 signaling pathway; Ovarian cancer; Proliferation; Metastasis; Invasion

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居第3位，死亡率卻居女性生殖細(xì)胞腫瘤的首位[2]。臨床上急需卵巢癌早期的腫瘤標(biāo)志物用于篩查，有利于為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)[3]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）對卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展起重要的作用，有望為卵巢癌的治療提供新思路[4]。研究表明，lncRNA AC007405.3在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，lncRNA AC007405.3可成為卵巢癌診斷的指標(biāo)，及早期篩查。本研究將該lncRNA命名為卵巢癌進(jìn)展相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（OCPAT1）。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）實(shí)驗(yàn)顯示，OCPAT1主要定位在細(xì)胞質(zhì)，目前挑選miR-320d作為OCPAT1潛在的靶向微小RNA（miRNA）， 同時miR-320d靶向YOD1。本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌ES-2細(xì)胞探討lncRNA OCPAT1/miR-320d/YOD1軸在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，為靶向治療卵巢癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

卵巢癌細(xì)胞株與正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE-80均購自中科院上海生科院細(xì)胞庫。miR-320d mimic、miR-320d抑制物及其各自陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;胎牛血清（FBS）購自美國 Invitrogen公司;lncRNA OCPAT1 siRNA 及其陰性對照均購自美國 Dharmacon公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司;Matrigel購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;MTT檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）試劑盒均購自VAZYME公司;熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報告載體均購自美國 Promega 公司。以上研究方案已得到福建省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1 篩選確認(rèn)研究的lncRNA? 應(yīng)用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫和基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫篩選出在正常組織和卵巢癌組織中有差異表達(dá)的lncRNA，進(jìn)行生存分析，確認(rèn)具有顯著差異的前5個lncRNA，檢測其在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)，最終選擇lncRNA AC007405.3（OCPAT1）。

1.2.2 qRT-PCR? 采用Trizol法提取ES-2中的總RNA，取1 μg RNA樣本用HiScript Reverse Transcriptase （VAZYME， R101-01/02）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA模板;然后使用相應(yīng)的引物（OCPAT1正向引物5-CAGTGCAATAGTATTGTCAAAGC-3，反向引物5-CACACAGAGGGCTACAAGAG-3;18 S rRNA正向引物5-GGAGTATGGTTGCAAAGCTGA-3，反向引物5-ATCTGTCAATCCTGTCCGTGT-3）和SYBR Green Master Mix（VAZYME，Q111-02）進(jìn)行qRT-PCR檢測，每組設(shè)3個復(fù)孔。計(jì)算公式如下：目的基因ΔΔCt=目的基因ΔCt-內(nèi)參基因ΔCt。

1.2.3 OCPAT1敲減質(zhì)粒構(gòu)建? 合成包含靶點(diǎn)序列的shRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的正反向引物（正向引物5-CGTTTAGTAAATG-3 -3，反向引物5-CAGCGAATCCT-CGTCG-3），退火后，使用T4 DNA連接酶，克隆入PLKO.1-TRC-puro慢病毒質(zhì)粒載體中。

1.2.4 YOD1過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建? 用設(shè)計(jì)好的引物（正向引物5-ATGTTTGGCCCCGCTAAAGG-3，反向引物5-CGGTGATGGCGGCAATTTG-3）以cDNA為模板，擴(kuò)增YOD1基因，連接進(jìn)pCDH-EF1a-MCS-T2A-puro載體（通過BamHI/EcoRI線性化后）。

1.2.5 MTT增殖實(shí)驗(yàn)? 將OCPAT1敲減質(zhì)粒和對照質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)ES-2細(xì)胞，第2天鋪于96孔板中，并在貼壁后0 h、24 h、48 h和72 h用MTT試劑染色活細(xì)胞約4 h，接著吸去培養(yǎng)上清，加入500 μL DMSO震蕩10 min，用分光光度計(jì)測定OD490讀值。

1.2.6 流式周期實(shí)驗(yàn)? 70%乙醇固定細(xì)胞過夜，清洗后處理細(xì)胞，清洗后PBS重懸并用PI染色，流式儀檢測。

1.2.7 EdU增殖實(shí)驗(yàn)? ES-2細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)相關(guān)質(zhì)粒，次日鋪于96孔板，并根據(jù)EdU試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 流式凋亡實(shí)驗(yàn)? 用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，同時也要收集培養(yǎng)基和清洗細(xì)胞PBS中的細(xì)胞。離心沖洗，100 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Anexin V-FITC和5 μLPI染色液，室溫反應(yīng)10 min，上機(jī)。

1.2.9 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)? Transwell底膜包稀釋后，風(fēng)干后加入無血清培養(yǎng)基。24 h后，細(xì)胞用冰甲醇固定20 min，然后用0.2%結(jié)晶紫染色20 min，通過顯微鏡隨機(jī)挑選視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)? ①構(gòu)建OCPAT1報告基因載體pmirGLO，48 h后收取細(xì)胞，進(jìn)行基因活性檢測。②構(gòu)建YOD1 3UTR的報告基因載體pmirGLO，48 h后收取細(xì)胞，要求進(jìn)行報告基因活性檢測。

1.2.11 FISH實(shí)驗(yàn)? 將ES-2細(xì)胞鋪在無菌的蓋玻片上培養(yǎng)，染完DAPI后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.12 Western blot檢測各組蛋白表達(dá)? 提取ES-2細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算灰度值比值，作為其蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，GraphPad Prism 5.01軟件作圖。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究OCPAT1的差異表達(dá)

①通過GTEX和TCGA數(shù)據(jù)庫，比對正常組織和腫瘤組織中OCPAT1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，OCPAT1在腫瘤組織中高表達(dá)（圖1）。②通過RT-qPCR，檢測OCPAT1在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果顯示OCPAT1在腫瘤細(xì)胞中顯著高表達(dá)。

2.2 敲減OCPAT1，研究OCPAT1對卵巢癌細(xì)胞功能的影響

OCPAT1敲除后，ES-2細(xì)胞的細(xì)胞增殖降低，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除ES-2細(xì)胞的OCPAT1，細(xì)胞增殖降低（封三圖4）。通過實(shí)驗(yàn)檢測在G0/G1期、S期相對減少（圖2）。同樣的，檢測得知敲減OCPAT1后，細(xì)胞凋亡增多（圖3）。采用Transwell migration實(shí)驗(yàn)和Matrigel invasion實(shí)驗(yàn)，兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，敲除OCPAT1后，會顯著抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的遷移和侵襲能力（P<0.001）。

2.3 檢測OCPAT1在卵巢癌細(xì)胞中的定位

采用FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OCPAT1主要定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.4 驗(yàn)證OCPAT1靶向miR-320d

①敲減OCPAT1，檢測miR-320d在ES-2細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果顯示升高。②將野生型和突變型OCPAT1分別克隆于螢火蟲熒光素酶基因上游，雙熒再分別與miR-320d或miRNA-ctrl同時瞬轉(zhuǎn)ES-2細(xì)胞，降解下游luciferase，熒光讀值降低，其他組不變。

2.5 驗(yàn)證miR-320d靶向YOD1

①ES-2細(xì)胞過表達(dá)miR-320d，qPCR和WB檢測YOD1表達(dá)量，結(jié)果顯示降低。②將YOD1 3UTR克隆于螢火蟲熒光素酶基因上游，與miR-320d或miRNA-ctrl同時瞬轉(zhuǎn)ES-2細(xì)胞，抑制下游luciferase的轉(zhuǎn)錄，熒光讀值降低，對照組不變。

2.6 進(jìn)一步驗(yàn)證OCPAT1/miR-320d/YOD1通路

①敲減OCPAT1，檢測YOD1在ES-2細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果顯示降低。②敲減OCPAT1，同時過表達(dá)YOD1，顯示過表達(dá)YOD1逆轉(zhuǎn)了由于OCPAT1敲減引起的細(xì)胞功能改變。

3討論

卵巢位于女性盆腔，屬于腹膜后位器官，目前缺乏有效的篩查手段，所以良性或早期惡性卵巢腫瘤一般較難發(fā)現(xiàn)，使得近75%的患者發(fā)現(xiàn)即為晚期[5]。目前針對卵巢癌的治療以手術(shù)及以鉑類為基礎(chǔ)的化療為主，盡管手術(shù)技能與化療方案不斷改進(jìn)，但卵巢癌的5年生存率仍提升緩慢[6]。隨著對卵巢癌標(biāo)志物研究的深入、影像學(xué)診斷方法的進(jìn)步及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用等，卵巢癌的診斷水平不斷提高，但仍未能滿足臨床的需要，目前僅25%的卵巢癌患者能早期發(fā)現(xiàn)。由于目前尚無高敏感度和特異度的血清腫瘤標(biāo)志物， 故傾向于多種血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測[7-8]。

人類基因組約有超30億個DNA堿基對，其中含有2.0萬～2.5萬個蛋白質(zhì)編碼基因，這些蛋白質(zhì)編碼基因只占據(jù)不到2%的基因組序列，剩余的近99% DNA均位于非編碼區(qū)，且基因組70%～90%轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA[9]。參與基因調(diào)控的非編碼RNA主要分為兩類：短片段非編碼RNA（siRNA、microRNA、piRNA）和長片段非編碼RNA（lncRNA）。研究表明，lncRNA在生命活動中具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、蛋白質(zhì)翻譯等多種作用，同時與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。

近年來，越來越多的研究表明，lncRNA對卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展起重要的作用。如lncRNA EWSAT通過靶向miR-330-5p，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，加快癌癥的發(fā)展[11];lncRNA LINC00319可通過miR-423-5p/NACC1通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12];lncRNA NEAT1可以提高卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性[13];另外，lncRNA PTAR可以調(diào)節(jié)ZEB1的表達(dá)，亦促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度為20～24個核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[15]。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個基因。關(guān)于lncRNA與miRNA在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用研究較少，因此探討lncRNA與miRNA的相互作用在卵巢癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮的作用，有望為卵巢癌的治療提供新思路[16]。

YOD1作為Otubain去泛素化酶家族重要成員之一，被報道與多種疾病密切相關(guān)，包括腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，提示其具有非常重要的生物學(xué)功能。YOD1蛋白可以通過調(diào)控LATS的E3連接酶ITCH的泛素化水平調(diào)控hippo信號通路，被認(rèn)為是治療肝癌的潛在靶標(biāo)。并且YOD1蛋白與宮頸癌、神經(jīng)退行性疾病、抗病毒免疫應(yīng)答之間均有相關(guān)性報道。這些研究均提示YOD1蛋白對相關(guān)蛋白的泛素化水平調(diào)控參與到細(xì)胞重要的生命活動中，但目前YOD1基因與卵巢癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚沒有文獻(xiàn)報道，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA OCPAT1可能在卵巢癌的發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因作用。lncRNA OCPAT1可能主要通過增強(qiáng)ES-2細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲能力進(jìn)而參與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程。應(yīng)用starBase網(wǎng)站預(yù)測出 lncRNA OCPAT1可互補(bǔ)結(jié)合miR-320d。為驗(yàn)證lncRNA OCPAT1靶向調(diào)控miR-320d表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展，本研究共同抑制lncRNA OCPAT1、miR-320d表達(dá)觀察細(xì)胞活性、遷移及侵襲變化，結(jié)果說明lncRNA OCPAT1可直接靶向調(diào)控miR-320d/YOD1表達(dá)，促進(jìn)ES-2細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程。

綜上所述，lncRNA OCPAT1在卵巢癌組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生及惡性化進(jìn)展有關(guān)，敲減ES-2細(xì)胞中OCPAT1表達(dá)靶向miR-320d/YOD1可抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲力，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步開展相關(guān)研究以明確。

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（收稿日期：2021-07-26）