Notch信號通路介導(dǎo)的自噬改變在多囊卵巢綜合征中的作用及機(jī)制研究*

任楠楠，周 珊，劉紅莉△

(1.西安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 710004;2.西北婦女兒童醫(yī)院生殖婦科，西安 710039)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種女性常見的生殖內(nèi)分泌疾病，能夠引起卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞和卵泡細(xì)胞發(fā)育障礙，導(dǎo)致不孕和不良妊娠的結(jié)局[1-2]。研究表明，PCOS影響著5%～10%的育齡女性。PCOS主要臨床表現(xiàn)為肥胖、血脂異常及胰島素抵抗(IR)等。目前針對PCOS病理機(jī)制的研究較多，主要認(rèn)為與基因的改變相關(guān)，例如一些合成激素分泌相關(guān)的基因、炎性因子、脂代謝相關(guān)基因及自噬相關(guān)基因等[3]。卵巢中的細(xì)胞反應(yīng)可能是PCOS的最初病理機(jī)制，進(jìn)而引起下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamus-pituitary-ovary axis，HPO)紊亂，激素水平出現(xiàn)異常導(dǎo)致臨床癥狀的產(chǎn)生。自噬是細(xì)胞發(fā)生的不同于凋亡的程序性死亡，過度的自噬對細(xì)胞來說無疑是一種損傷[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，卵巢中的顆粒細(xì)胞若發(fā)生過度自噬，則可能導(dǎo)致PCOS的發(fā)生。Beclin1蛋白分子是自噬發(fā)生的關(guān)鍵分子，是自噬泡形成的重要組成部分。Beclin1分子表達(dá)的水平能夠間接反映細(xì)胞自噬的狀態(tài)。調(diào)控自噬發(fā)生的信號通路較多，mTOR是最經(jīng)典的一條通路，mTOR對自噬的發(fā)生能夠起到負(fù)面的調(diào)控作用[5]。然而對于mTOR上游調(diào)控的機(jī)制仍未闡明，深入研究PCOS過程中卵巢細(xì)胞Notch信號通路的改變，觀察Notch信號通路與mTOR相關(guān)分子的關(guān)系，闡明Notch信號通路對自噬表達(dá)水平的影響，將會為PCOS的防治提供理論依據(jù)和分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠(購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)；來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥)；HE染色試劑(武漢谷歌生物公司)；戊巴比妥鈉(北京化工廠)；Jagged1(美國Sigma公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、RMPI-1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；Actin、Beclin 1、mTOR、p70s6k、LC3、Hes1和Notch 1抗體(英國Abcam公司)；二甲亞砜(DMSO，美國Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠POCS模型的建立

運(yùn)用MALIQUEO等[6]的方法，用來曲唑200 μg/d灌胃的方式建立PCOS大鼠模型。將體質(zhì)量約為200 g的SPF級雌性SD大鼠40只，分為對照組、來曲唑干預(yù)組(200 μg/d)、Jagged1處理組、來曲唑+Jagged1處理組。SD大鼠每天保持光照12 h，環(huán)境溫度控制在20～24 ℃，濕度范圍是60%±5%，自由進(jìn)食和飲水。

1.2.2血清樣本及卵巢組織的采集

實(shí)驗(yàn)各組SD大鼠末次灌胃給藥后禁食過夜，次日稱量各組SD大鼠體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉麻醉后，剝離胸腔，暴露心臟，從心房抽取靜脈血，室溫放置30 min，2 500 r/min離心15 min，取上清液分裝凍存在-80 ℃冰箱中備用。抽取靜脈血后，在SD大鼠腰椎背側(cè)用75%乙醇消毒，雙側(cè)分別做一1 cm左右的切口，取出SD大鼠的雙側(cè)卵巢。一側(cè)用4%多聚甲醛固定，另一側(cè)放于離心管中存入-80 ℃冰箱。

1.2.3激素水平的測定

通過化學(xué)發(fā)光法對各組SD大鼠血清中的雌二醇(E2)、促卵泡生長激素(FSH)、促黃體生成素(LH)進(jìn)行檢測。具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，每組各設(shè)兩個復(fù)孔，保證結(jié)果相對偏差在±15%范圍內(nèi)，變異系數(shù)小于15%。

1.2.4卵巢HE染色

將在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上的卵巢組織，常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行組織切片，厚度為3～4 μm，行HE染色：(1)二甲苯脫蠟；(2)乙醇水化；(3)蘇木精染色；(4)1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10～20 s；(5)伊紅染色；(6)脫水，透明，封片。

1.2.5Hela 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測

Hela細(xì)胞常規(guī)37℃、5%的CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞分為4組：空白對照組、白頭翁皂苷B4處理組(20 mg/mL)、Jagged1處理組、Jagged1+白頭翁皂苷B4處理組(20 mg/mL)。細(xì)胞接種在96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁處于良好狀態(tài)下每孔加入20 μL濃度是5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，用移液器分別吸去各孔中的上清液，每孔加入150 μL DMSO，運(yùn)用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.6Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白和信號通路

將4組處理的Hela細(xì)分別運(yùn)用蛋白提取試劑盒提取蛋白樣品，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白濃度定量，蛋白濃度配平后放入-80 ℃冰箱保存。進(jìn)行凝膠電泳(恒流條件下實(shí)施電壓80 V，電泳時間為120 min)，電轉(zhuǎn)(恒壓條件下實(shí)施電流250 mA，電轉(zhuǎn)時間為90 min)。4 ℃一抗(β-actin、Beclin 1、LC3、Hes1、Notch 1)孵育16 h，二抗室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光法顯色。各組以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PCOS大鼠模型的建立

與對照組相比，PCOS模型組SD大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，見圖1A；PCOS組與對照組相比血清中E2、FSH水平顯著降低(P<0.05)，見圖1B；對照組卵巢呈現(xiàn)大量黃體形態(tài)結(jié)構(gòu)，存在不同發(fā)育階段的卵泡：例如竇狀卵泡、排卵前卵泡。卵泡顆粒細(xì)胞層排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。PCOS模型組卵巢則顯現(xiàn)為病理性的改變，黃體結(jié)構(gòu)較少，并且發(fā)現(xiàn)卵泡大量擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層排列稀疏，沒有放射冠及卵母細(xì)胞存在，存在卵巢間質(zhì)細(xì)胞增生，卵巢呈典型多囊樣變性病變，見圖1C。

A：PCOS建模過程中各組體質(zhì)量的改變；B：各組血清中雌二醇及促卵泡生長素的改變；C：HE染色檢測各組形態(tài)學(xué)改變；*:P<0.05。

2.2 PCOS能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生

Western blot檢測顯示PCOS模型組與對照組相比自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖2A。RT-PCR檢測顯示PCOS模型組與對照組相比自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖2B。

**:P<0.01。

2.3 PCOS能夠抑制Notch信號通路的活化

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PCOS模型組與對照組相比，Notch1、Hes1蛋白處于抑制狀態(tài)，見圖3。

**:P<0.01。

2.4 激活Notch信號通路能夠降低自噬的發(fā)生，進(jìn)而抑制PCOS的病理發(fā)生

Jagged1干預(yù)能夠引起Notch信號通路激活，與來曲唑共同處理后發(fā)現(xiàn)，來曲唑處理組的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，自噬發(fā)生可能受到抑制，同時，Jagged1+白頭翁皂苷B4處理組，細(xì)胞活力與單純白頭翁皂苷B4處理組增加，見圖4。

A：對照組;b:來曲唑干預(yù)組;c:Jagged1干預(yù)組;d:來曲唑+Jagged1干預(yù)組;*:P<0.05;**:P<0.01。

3 討 論

PCOS是當(dāng)今影響育齡女性不孕不育的主要疾病，并對機(jī)體的內(nèi)分泌存在一定的影響。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，本研究首先檢測了PCOS模型建立的是否成功，運(yùn)用目前對于PCOS模型檢測的幾個指標(biāo)進(jìn)行觀察：血清中E2、FSH表達(dá)水平及卵巢組織的形態(tài)學(xué)觀察[7]。發(fā)現(xiàn)PCOS模型組與對照組相比血清中E2、FSH水平顯著降低，形態(tài)學(xué)檢測也發(fā)現(xiàn)卵巢病理性的改變：黃體結(jié)構(gòu)較少，并且發(fā)現(xiàn)卵泡大量擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層排列稀疏，沒有放射冠及卵母細(xì)胞存在，存在卵巢間質(zhì)細(xì)胞增生，卵巢呈典型多囊樣變性病變。諸多的結(jié)果表明本研究PCOS模型建立成功。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種生理活動，在細(xì)胞各種應(yīng)激過程中均會表達(dá)異常，有研究指出自噬與許多疾病的發(fā)生存在著緊密的聯(lián)系[8]。為了進(jìn)一步揭示PCOS的發(fā)病機(jī)制，本研究檢測了PCOS卵巢組織中自噬水平的表達(dá)情況，Beclin1和LC3分別是自噬發(fā)生過程中的關(guān)鍵蛋白分子，兩種蛋白水平的改變可以代表細(xì)胞自噬的水平[9]。Western blot檢測提示PCOS模型組自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1表達(dá)水平增高。研究表明，自噬屬于細(xì)胞的第二程序性死亡，參與細(xì)胞多項(xiàng)生理活動，且自噬的發(fā)生可能與PCOS關(guān)系密切[10-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)PCOS模型組自噬水平上調(diào)，提示自噬的異常表現(xiàn)可能是導(dǎo)致PCOS的病理機(jī)制之一。調(diào)控自噬發(fā)生的信號通路較多，其中最為經(jīng)典的為mTOR/p70s6k信號通路[12]。本研究為揭示PCOS模型中引起自噬水平升高的分子機(jī)制，運(yùn)用Western blot檢測了mTOR/p70s6k信號通路的活化狀態(tài)，提示PCOS抑制了mTOR/p70s6k信號通路。PCOS很可能是通過mTOR/p70s6k信號通路調(diào)節(jié)自噬發(fā)生的。Notch信號通路與mTOR關(guān)系緊密，且參與細(xì)胞的免疫、應(yīng)激、生長、分化及細(xì)胞增殖等各項(xiàng)生命活動[13-15]。本研究檢測了Notch信號通路相關(guān)分子的改變情況，結(jié)果提示PCOS能夠抑制Notch信號通路上的相關(guān)分子Notch1，Hes1，Notch信號通路可能參與了PCOS的病理發(fā)生過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Notch信號通路在PCOS發(fā)病過程中的分子機(jī)制和作用，運(yùn)用Notch信號通路的一種激活劑Jagged1在PCOS建模過程中進(jìn)行干預(yù)，觀察Notch信號通路激活后自噬水平和PCOS病理進(jìn)程的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Notch激動劑的干預(yù)，PCOS模型建立的過程中病理進(jìn)程有所緩解，血清中E2、FSH水平與模型組相比有所升高，提示Notch信號通路活化能夠改善PCOS的發(fā)生。用Western blot檢測了Notch信號通路活化后，mTOR/p70s6k信號通路的改變，結(jié)果提示，mTOR/p70s6k信號通路與模型組相比處于活化狀態(tài)。本研究檢測了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的水平，經(jīng)過Notch信號通路激活劑干預(yù)后，卵巢組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)受到抑制。驗(yàn)證了Notch信號通路對自噬具有一定的調(diào)控作用，且激活Notch信號通路改善PCOS的發(fā)生很可能是通過調(diào)控自噬來完成的。

本研究證實(shí)了自噬的發(fā)生在PCOS發(fā)生中的重要作用，進(jìn)一步揭示了mTOR/p70s6k信號通路及Notch信號通路的改變，闡明了Notch信號通路對自噬的調(diào)控作用在PCOS發(fā)生過程中的重要意義。為臨床上PCOS的治療和預(yù)防提供了重要的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。