免疫應(yīng)答細(xì)胞因子基因的多態(tài)性對FⅧ抑制物形成的影響*

李 芬,楊金榮，武 坤 綜述，曾 云 審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

血友病是凝血因子缺乏導(dǎo)致的遺傳性出血性疾病，包括血友病A(HA)和血友病B(HB)[1]。男性HA的發(fā)病率約為1/5 000。HA是由位于X染色體上凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因突變或缺失導(dǎo)致的FⅧ功能缺陷，占血友病的80%～85%[2]。血友病的特點是反復(fù)出血，主要發(fā)生在關(guān)節(jié)和肌肉中，隨著時間的推移，關(guān)節(jié)出血造成軟骨和骨骼損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)病變。

目前FⅧ替代治療是血友病唯一有效的治療方法。HA的治療過程中，會產(chǎn)生抗FⅧ的中和抗體(抑制物),高達(dá)30%的未經(jīng)治療的嚴(yán)重HA的患者治療中會產(chǎn)生抑制物，抑制物通過中和輸注的FⅧ，降低了治療的有效性并影響藥物動力學(xué)，為了清除針對FⅧ的同種抗體，常用免疫耐受誘導(dǎo)策略。然而，這種治療成本高，需要長期定期輸注高劑量FⅧ，且成功率僅為60%～80%[3]。抑制物的產(chǎn)生是替代治療面臨的最大挑戰(zhàn)，不僅增加了治療難度和費用，也增加了患者的致殘率和病死率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4-5]。

預(yù)測血友病患者產(chǎn)生抑制物的風(fēng)險的大小，找出影響抑制物產(chǎn)生的因素，有助于及早采取措施預(yù)防抑制物的產(chǎn)生，對于高風(fēng)險的患者可以進(jìn)行更有效的免疫耐受誘導(dǎo)。

1 抑制物的產(chǎn)生機(jī)制

FⅧ抑制物形成的機(jī)制尚未完全明了，一般認(rèn)為抗FⅧ免疫應(yīng)答主要是CD4+T細(xì)胞依賴性體液免疫應(yīng)答，B細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞增殖和抗體生產(chǎn)[6-7]。主要是抗原遞呈細(xì)胞：APC(主要為樹突狀細(xì)胞)、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞共同作用的結(jié)果。APC可將抗原肽與Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(MHCⅡ)分子結(jié)合形成復(fù)合物。外源性FⅧ即抗原肽，F(xiàn)Ⅷ被APC攝取加工與MHCⅡ類分子結(jié)合形成FⅧ-MHCⅡ分子復(fù)合物，轉(zhuǎn)運至APC表面，供CD4+T細(xì)胞識別。CD4+T細(xì)胞與APC表面的MHCⅡ分子結(jié)合后被激活并可分泌細(xì)胞因子，增殖分化形成效應(yīng)性T細(xì)胞(Th1/Th2細(xì)胞)[9]。Th1細(xì)胞可分泌γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)等，主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過募集和活化巨噬細(xì)胞引發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)，在宿主抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用；Th2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，主要參與體液免疫應(yīng)答?？笷Ⅷ反應(yīng)主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)。B細(xì)胞與FⅧ結(jié)合后將其攝入并加工處理，以FⅧ-MHCⅡ類分子復(fù)合物形式遞呈給特異性Th2細(xì)胞，并在Th2細(xì)胞分泌的IL-4的協(xié)助下形成活化的B細(xì)胞，活化的B細(xì)胞可對Th細(xì)胞及APC所分泌的細(xì)胞因子產(chǎn)生反應(yīng)：IL-2、IL-4和IL-5可促進(jìn)B細(xì)胞增殖，經(jīng)歷幾輪增殖后在IL-5、IL-6等作用下，B細(xì)胞分化為能產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞，從而產(chǎn)生FⅧ特異性抗體[10]。

2 影響抑制物產(chǎn)生的因素

2.1 非遺傳因素

(1)初次治療的年齡：初次治療的年齡越小，F(xiàn)Ⅷ抑制物產(chǎn)生率越高；(2)FⅧ輸注的強(qiáng)度：持續(xù)輸注FⅧ制劑，抑制物產(chǎn)生率更高；(3)輸注FⅧ的種類：重組的FⅧ抑制物產(chǎn)生率高于血漿源性產(chǎn)品；(4)預(yù)防治療的方法及合并感染等[11]。

2.2 遺傳因素

(1)種族、家族史；(2)FⅧ基因突變的類型。目前發(fā)現(xiàn)HA總共2 107個已知突變，凝血因子突變型是影響抑制物產(chǎn)生的重要因素，在HA中，與具有錯義突變或小缺失的患者比較，具有更嚴(yán)重突變(例如內(nèi)含子22倒位，大缺失和無義突變)的患者中抑制物產(chǎn)生的頻率更高，在F8基因突變中，導(dǎo)致完全缺乏蛋白質(zhì)表達(dá)的無效突變患者中抑制物產(chǎn)生的風(fēng)險最高。

3 抑制物與免疫的關(guān)系

遺傳因素和非遺傳因素的聯(lián)合作用對抑制物的產(chǎn)生具有重要意義。這些因素可以通過細(xì)胞因子激活或抑制免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子是由不同細(xì)胞對抗原產(chǎn)生的一組可溶性蛋白，它們對天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子分泌失衡可能影響機(jī)體初次接觸外源性FⅧ后抑制物的產(chǎn)生，而細(xì)胞因子的表達(dá)和產(chǎn)生在一定程度上是由基因決定的。與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子的基因多態(tài)性可影響細(xì)胞因子的表達(dá)從而影響FⅧ抑制物的生成。

免疫調(diào)節(jié)因子基因的多態(tài)性，包括編碼MHC Ⅱ類系統(tǒng)的基因，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，IL-10和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA4)等被認(rèn)為是抑制物產(chǎn)生風(fēng)險的決定因素[12-13]。

4 基因多態(tài)性

基因多態(tài)性的意思是在一個生物群體中，存在兩種及以上不連續(xù)的變異型、基因型或等位基因。生物群體中基因多態(tài)性的現(xiàn)象十分普遍。人類基因多態(tài)性通常分為3大類:DNA片段長度多態(tài)性(fragment length polymorphism，F(xiàn)LP)、DNA重復(fù)序列多態(tài)性(repeat sequence polymorphism，RSP)、單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。細(xì)胞因子基因調(diào)控區(qū)的SNP在許多人群中普遍存在，可通過影響細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改變免疫反應(yīng)的過程[14]。因此，這些細(xì)胞因子的基因頻率在不同人群中的任何差異都可能具有臨床意義，對于獲得特異性遺傳標(biāo)記來幫助疾病診斷和預(yù)后具有重要意義。

4.1 IL-10

IL-10是一種主要由效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)因子,具有很多生物學(xué)活性，可作為全身炎癥免疫反應(yīng)的一種抑制因子，同時可以促進(jìn)活化B淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白。IL-10基因位于染色體lq31、32上，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子[15]。其中有的多態(tài)性發(fā)生在啟動子，有的位于非編碼區(qū)的內(nèi)含子。IL-10啟動子中3個位點的多態(tài)性可能改變IL-10基因的表達(dá)：1082(G>A)，819(T>C)和592(C>T)位點[16]。這3個位點的基因型與IL-10表達(dá)量相關(guān)。體外研究表明1082G等位基因的IL-10產(chǎn)量較高，而1082A等位基因的IL-10產(chǎn)量較低。IL-10基因的多態(tài)性通過影響IL-10的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響IL-10的表達(dá)量，影響免疫應(yīng)答的過程。PAVLOVA等[17]的研究中，F(xiàn)Ⅷ抑制物陽性的血友病患者1082G/G基因的頻率較抑制物陰性者明顯升高。抑制物陽性的血友病患者GCC核型頻率較高，而ACC核型頻率較低。國外很多文獻(xiàn)[18-19]也得出一致的結(jié)論。CHAVES等[20]認(rèn)為1082、819、592基因的突變是抑制物產(chǎn)生的危險因素。我國王學(xué)鋒[21]研究了1 435例HA患者，通過IL-10基因的-819C/T、-592A/C多態(tài)性檢測,得出-819T、-592A患者比-819C、-592C患者更容易產(chǎn)生抑制物的結(jié)論。LU等[16]認(rèn)為819、592基因的突變是抑制物產(chǎn)生的危險因素。

4.2 CTLA4

CTLA4是免疫球蛋白超家族成員，可以編碼抑制T淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白。CTLA4基因位于染色體2q33上，有4個外顯子，只表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，可抑制T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)[22]。CTLA4與CD28具有同源性,能與CD28競爭性與抗原遞呈細(xì)胞上的配體B7結(jié)合，構(gòu)成T淋巴細(xì)胞活化的第二信號。CD28與B7結(jié)合在T細(xì)胞激活中起正向調(diào)節(jié)作用，而CTLA4與B7的結(jié)合則起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。但CTLA4與B7的親和力比CD28高至少100倍，可阻斷CD28信號[23]。CTLA4基因突變可影響CTLA4與B7親和力，削弱其對T細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致T細(xì)胞異常活化、抗體生成和疾病發(fā)生。在FⅧ缺陷小鼠上已證明，用CTLA4抑制抗原遞呈細(xì)胞上的B7與T淋巴細(xì)胞上的CD28之間的相互作用可以防止抑制物的產(chǎn)生。ABDULQADER等[24]研究了CTLA4基因的3種多態(tài)性，證明49A>G基因與FⅧ抑制物產(chǎn)生有關(guān)。表明CTLA4的多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)這種共刺激分子的水平而對FⅧ的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。另有研究表明，啟動子-318C/T多態(tài)性能影響CTLA4分子的表達(dá)[25]。CTLA4的基因多態(tài)性(啟動子318 C/T和第1外顯子49A/G)與該分子在細(xì)胞表面不同程度的表達(dá)有關(guān)[26]。抑制劑的產(chǎn)生與318T等位基因之間存在顯著的保護(hù)性關(guān)聯(lián)，但與49A/G多態(tài)性無關(guān)[27]。另一方面，獲得性血友病A患者CTLA4 49A/G多態(tài)性發(fā)生頻率高于健康人群[28]。

4.3 TNF-α

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞分泌，在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。TNF-α基因有4個外顯子和3個內(nèi)含子，位于6號染色體短臂Ⅲ類MHC區(qū)域,該區(qū)域與某些疾病發(fā)生有關(guān)[29]。TNF-α基因的SNP多發(fā)生在TNF-α基因的啟動子區(qū)內(nèi)-308G/A 位點。該位點由-308G/A(GG)、-308G/A(GA)和-308G/A(AA)這3種基因型組成。TNF-α308G/A多態(tài)性可能影響TNF-α的表達(dá)。-308G/A 位點的A等位基因可增強(qiáng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，該位點G/A的突變使TNF-α基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平失常,導(dǎo)致TNF-α表達(dá)異常而誘導(dǎo)過強(qiáng)的免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)。雖然FⅧ抑制性抗體的產(chǎn)生是Th2細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，TNF-α主要與Th1細(xì)胞有關(guān)。但是，參與抑制物形成的細(xì)胞因子是Th1和Th2細(xì)胞的共同反應(yīng)，這進(jìn)一步說明，TNF-α水平也可能參與調(diào)節(jié)血友病患者FⅧ的免疫應(yīng)答。SOORI等[30]研究的結(jié)果表明TNF-αrs1800629 G>A多態(tài)性降低了甲型血友病患者中抑制物形成的風(fēng)險；張露璐等[31]研究表明TNF-α-308G/A基因多態(tài)性可提示FⅧ抑制物產(chǎn)生的風(fēng)險。

4.4 HLA-Ⅱ

人類MHC，即編碼人類白細(xì)胞抗原(HLA)的基因群稱為HLA復(fù)合體。HLA復(fù)合體位于第6號染色體短臂6p21.31，長度約300～4 000 kb，共有239個基因座位。分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。HLA-Ⅱ類基因由DP、DQ、DR 3個亞區(qū)組成，其編碼的基因及其產(chǎn)物在機(jī)體免疫和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[32]。對于細(xì)胞外蛋白，如HA患者注射的外源性FⅧ，是HLA-Ⅱ類分子介導(dǎo)抗原肽的加工。HLA是人體多態(tài)性最豐富的基因系統(tǒng)。HLA-Ⅱ類分子主要參與抗原的處理與遞呈，在將外源性的FⅧ遞呈到CD4+陽性的輔助T細(xì)胞中起著重要作用。特別是HLA-Ⅱ類等位基因，據(jù)報道，DRB 1*15和DQB 1*0602對抑制劑的產(chǎn)生有影響[33]。FⅧ抑制劑陽性的患者中DRB1*15和DQB1*0602基因的頻率增高[17,34]。HOSSEINI等[35]研究發(fā)現(xiàn)無抑制物產(chǎn)生的血友病患者HLA-DRB1*01:01等位基因顯著高于對照組，且認(rèn)為該等位基因?qū)ρ巡』颊呔哂斜Ｗo(hù)作用。KIM等[36]在韓國患者中研究發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅱ類中，DRB1*15與抑制物的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)，而C*07:02與抑制物的產(chǎn)生呈正相關(guān)。血友病患者產(chǎn)生抑制因子的免疫應(yīng)答基因大多與HLA-Ⅱ類等位基因有關(guān)[37]：HLA-DRB1*14，DRB1*15，HLA-DQB1*06：02，DQB*06：03，HLA-Ⅱ類等位基因。DQA1*01：02和DQA1*01：03和DRB1*15：01/DQB1*06：02單倍型。

5 展 望

免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在抑制物產(chǎn)生及血友病預(yù)防治療效果中具有重要的作用。可以通過預(yù)測這些因素，有效避免FⅧ抑制物的生成，并提供更有效的治療。參與免疫調(diào)節(jié)的因子IL-10、TNF-α、CTLA4、HLA-Ⅱ類分子等均可影響抑制物的生成，而這些因子的產(chǎn)生與基因的多態(tài)性密切相關(guān)，所以免疫調(diào)節(jié)因子基因的多態(tài)性與FⅧ抑制物產(chǎn)生的風(fēng)險有關(guān)?；蚨鄳B(tài)性受很多因素的影響，如民族、人種、環(huán)境等，我國有多個少數(shù)民族分布，民族差異對基因多態(tài)性的影響仍需更多的研究，這將有助于針對民族差異為患者提供更有效的診治。