miR-198過表達(dá)抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長及侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫，胥 朵，李少海，張文信 (.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院西醫(yī)臨床教研室，陜西 渭南 7406;.渭南市中醫(yī)醫(yī)院骨科，陜西 渭南 7406)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)作為兒科比較常見的一種眼內(nèi)惡性腫瘤，全球范圍的發(fā)病率為1/20 000[1]。RB在非洲及一些發(fā)展中國家的發(fā)病率較高，并且患兒的5年生存率要低于發(fā)達(dá)國家[2]。RB發(fā)現(xiàn)越早其治愈的可能性越高，由于發(fā)病初期腫瘤體積小，并位于視網(wǎng)膜周邊，不會有明顯的視力影響，而一旦出現(xiàn)眼部癥狀后，治愈的可能性則明顯降低[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其核苷酸序列長度一般為19～25 bp，在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。近年來大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),miRNA可作為原癌基因或抑癌基因參與到腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中，因此miRNA具有成為治療癌癥靶點(diǎn)的潛在價值[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-198能夠通過抑制HGF/c-MET信號途徑提高非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6],并且能夠通過調(diào)節(jié)ADAM28/JAK-STAT信號通路影響大腸癌的增殖和凋亡[7]，還能夠抑制TLR4蛋白表達(dá)及胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]，但miR-198在RB細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚未明確。因此本研究通過在RB細(xì)胞株系Y79細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-198模擬物，以探究miR-198對RB細(xì)胞生長、侵襲的影響，并進(jìn)行裸鼠體內(nèi)荷瘤試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-198 mimic及miR-NC(上海吉凱基因技術(shù)有限公司)，脂質(zhì)體、Lipofectamine?2000(美國Thermo Fisher Scientific)，10%胎牛血清(美國Gibco公司)，100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素(美國Invitrogen公司)，TRIzol Kit、Revertaid First Strand cDNA Kit(Thermo Fisher科學(xué)公司)，兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH以及兔抗小鼠Ki67、SOX2、VEGF單克隆抗體(美國Abcam公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(碧云天公司)，鋪有Matrigel膠的Transwell小室(美國BD公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Beckman Coulter)，正置熒光顯微鏡(日本Thermo)，實(shí)時熒光定量PCR儀(羅氏診斷)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RB Y79細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的完全RPMI 1640培養(yǎng)液中，并在37 ℃的5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，隨后以0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為空白對照組(Control組)、陰性對照組和過表達(dá)組，參照試劑盒操作說明采用Lipofectamine?2000將miR-NC、miR-198模擬物分別轉(zhuǎn)染至陰性對照組和過表達(dá)組的Y79細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，若發(fā)出綠色熒光信號則視為轉(zhuǎn)染陽性，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-198表達(dá)水平

Trizol法提取各組中的總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，利用Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR-Green PCR Mix試劑盒檢測mRNA的表達(dá)水平。PCR參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，并根據(jù)溶解曲線分析結(jié)果是否為特異性擴(kuò)增。miR-198上游引物：5′-GGTCCAGAGGGGAGAT-3′；下游引物：5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′。內(nèi)參基因U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′；下游引物：5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。應(yīng)用2-△△Ct法分析miR-198的相對表達(dá)水平。

1.4 干細(xì)胞成球試驗(yàn)檢測Y79細(xì)胞增殖能力

將各組Y79細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度至1×105/mL,接種至6孔板上，加入含有2%胎牛血清、10 μg/mL胰島素、20 ng/mL表皮生長因子、20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 ng/mL B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、500 ng/mL氫化可的松的干細(xì)胞培養(yǎng)液后，放入37 ℃的5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，之后在光學(xué)顯微鏡下觀察干細(xì)胞成球的直徑及數(shù)量，并拍照記錄。

1.5 Transwell小室試驗(yàn)檢測Y79細(xì)胞侵襲能力

將鋪有Matrigel膠的Transwell小室預(yù)熱至37 ℃后，消化各組Y79細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3次后重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入300 μL細(xì)胞懸液后培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，用棉簽輕柔地擦去上層未穿膜的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用冰甲醛對濾膜進(jìn)行固定后結(jié)晶紫染色。將濾膜剝離后正面朝下固定在載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個高倍鏡(×400)下視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平

加入RIPA裂解液，提取各組培養(yǎng)48 h后的Y79細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA法對蛋白水平進(jìn)行定量，并利用Bradford將各組蛋白濃度調(diào)整一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH一抗(1∶500)，于4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 裸鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)

將適應(yīng)性培養(yǎng)的60只裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組和過表達(dá)組，每組30只，收集2組對數(shù)生長期的Y79細(xì)胞，制成密度為1×1010/L的細(xì)胞懸液后，分別進(jìn)行皮下注射，每只裸鼠注射200 μL，注射完成后，每5 d各組隨機(jī)處死3只裸鼠，取瘤體測量質(zhì)量及體積，30 d時處死剩余裸鼠，取平均值計(jì)算。瘤體中miR-198的mRNA相對表達(dá)水平檢測同1.3。所有操作均符合動物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 免疫組化法檢測瘤體中蛋白表達(dá)水平

將瘤體組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，脫水、PBS溶液漂洗、3%H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原修復(fù)、PBS漂洗5 min、加入一抗37 ℃反應(yīng)2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37 ℃反應(yīng)40 min、PBS漂洗5 min、DAB室溫顯色20～30 min，光學(xué)顯微鏡下觀察有棕黃色顆粒出現(xiàn)時則采用自來水終止。再用蘇木素復(fù)染30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察切片中Ki67、SOX2、VEGF的陽性表達(dá)細(xì)胞，其細(xì)胞漿表現(xiàn)為棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個視野，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算陽性細(xì)胞率，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0以及Graph Pad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果

qRT-PCR結(jié)果顯示，陰性對照組與Control組Y79細(xì)胞中miR-198的相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而過表達(dá)組Y79細(xì)胞中miR-198的相對表達(dá)水平較Control組及陰性對照組提高了58倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明過表達(dá)miR-198成功(圖1)。

*：與過表達(dá)組比較，P<0.05

2.2 過表達(dá)miR-198抑制Y79細(xì)胞增殖能力

干細(xì)胞成球試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對照組與Control組Y79細(xì)胞的成球直徑及數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而過表達(dá)組Y79細(xì)胞的成球直徑及數(shù)量較Control組及陰性對照組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 過表達(dá)miR-198抑制Y79細(xì)胞侵襲能力

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對照組與Control組Y79細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而過表達(dá)組Y79細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率較Control組及陰性對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

a：各組Y79細(xì)胞干細(xì)胞成球試驗(yàn)結(jié)果(×400)；b：各組Y79細(xì)胞的成球直徑和數(shù)量 *：與過表達(dá)組比較，P<0.05

a：各組Y79細(xì)胞Transwell試驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫，×400)；b：各組Y79細(xì)胞侵襲情況 *：與過表達(dá)組比較，P<0.05

2.4 過表達(dá)miR-198抑制Y79細(xì)胞Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，陰性對照組與Control組Y79細(xì)胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而過表達(dá)組Y79細(xì)胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達(dá)水平較Control組及陰性對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

a：蛋白表達(dá)圖譜；b：各組Y79細(xì)胞中Ki67、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)水平 *：與過表達(dá)組比較，P<0.05

a：蛋白表達(dá)圖譜；b：各組Y79細(xì)胞中VEGF、Fibronectin蛋白表達(dá)水平 *：與過表達(dá)組比較，P<0.05

2.5 過表達(dá)miR-198抑制Y79移植瘤體形成

過表達(dá)組裸鼠的移植瘤體質(zhì)量和體積均小于陰性對照組(P<0.05)，見圖6a～c。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)組裸鼠的移植瘤中miR-198相對表達(dá)水平高于陰性對照組(P<0.05)，見圖6d。免疫組化檢測顯示，過表達(dá)組裸鼠的移植瘤中Ki67、SOX2、VEGF的陽性表達(dá)率低于陰性對照組(P<0.05)，見圖7。

a：皮下注射后30 d裸鼠移植瘤；b：皮下注射后不同時間點(diǎn)移植瘤體積；c：皮下注射30 d裸鼠移植瘤體質(zhì)量；d：移植瘤中miR-198的相對表達(dá)水平 *：與陰性對照組比較，P<0.05

*：與陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

RB是一類由于RB1基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤，近年來其臨床治療效果取得了巨大的進(jìn)步，但在世界范圍內(nèi)RB的病死率及繼發(fā)腫瘤率依舊較高，早發(fā)現(xiàn)、早治療及遺傳咨詢是控制該病的關(guān)鍵[9]。鑒于臨床上對患兒生存質(zhì)量重視程度的不斷提高，RB治療的目標(biāo)逐漸由保障患兒生命轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ａ粞矍蛏踔烈暳Γ虼藢ζ渲委煼桨傅倪x擇提出了更高的要求[10]。常規(guī)化療聯(lián)合局部治療是臨床上最常用的方式，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展及RB病因?qū)W的深入研究，基因療法、干細(xì)胞療法、靶向治療等方式逐漸應(yīng)用于臨床[11]。miRNA作為單鏈短RNA，不具備開放閱讀框，因此不能進(jìn)行翻譯蛋白表達(dá)，但能夠通過與靶基因的3′或5′段UTR區(qū)完全或不完全結(jié)合來進(jìn)行表達(dá)的調(diào)控[12]。目前人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1 000種的miRNA，其不僅參與調(diào)控細(xì)胞的正常增殖凋亡過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的作用，已成為了世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)方向之一[13]。

miRNA在體內(nèi)既能夠作為原癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又能夠作為抑癌基因抑制腫瘤的進(jìn)展[14]。miR-198作為一類抑癌基因，在多種癌細(xì)胞中低表達(dá)[15-16]，并且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌和胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[17-18]。為了探究miR-198在RB中的可能機(jī)制，本研究選擇RB Y79細(xì)胞系為研究對象，并通過轉(zhuǎn)染miR-198模擬物獲得過表達(dá)細(xì)胞系，經(jīng)RT-PCR試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-198模擬物后，Y79細(xì)胞內(nèi)的miR-198表達(dá)水平升高了58倍。細(xì)胞的過度分裂及增殖是腫瘤癌變的重要環(huán)節(jié)，Ki67作為增殖性細(xì)胞核的標(biāo)志物，在細(xì)胞分裂G1后期、G2期和S期表達(dá)逐漸升高，在M期表達(dá)量達(dá)到最高峰，因此Ki67是評價細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)[19]。本研究顯示，過表達(dá)組Y79細(xì)胞內(nèi)Ki67表達(dá)水平明顯降低，提示miR-198可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，從而抑制細(xì)胞增殖。SOX家族具有高遷移率族蛋白結(jié)合區(qū)域，SOX2作為家族的重要成員之一，參與調(diào)控組織器官的形成以及發(fā)展，在維持干細(xì)胞特性方面具有重要作用；OCT4作為一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠維持干細(xì)胞的多潛能性以及未分化狀態(tài)[20]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在人類胚胎干細(xì)胞自我更新時miR-145呈現(xiàn)低表達(dá)，而在分化時miR-145能夠通過抑制SOX2及OCT4的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞分化[21]。本研究過表達(dá)組Y79細(xì)胞的干細(xì)胞成球能力明顯降低，且SOX2、OCT4蛋白表達(dá)水平也明顯降低，提示miR-198可能通過抑制SOX2、OCT4蛋白表達(dá)，從而降低Y79細(xì)胞的干細(xì)胞特征，進(jìn)而抑制其惡性增殖。

侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征[22]。VEGF能夠增加血管的通透性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵入血管，進(jìn)而向淋巴及遠(yuǎn)處細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[23]。Fibronectin蛋白作為間質(zhì)細(xì)胞源性標(biāo)志物，其水平升高表明細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而間質(zhì)細(xì)胞的增加會使得腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，其侵襲及遷移能力明顯提高[24]。本研究顯示，過表達(dá)組Y79細(xì)胞中VEGF、Fibronectin蛋白水平明顯降低，提示miR-198可能通過抑制Y79細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，與Hu等[25]的研究一致。本研究通過移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了在體內(nèi)過表達(dá)miR-198后能夠明顯抑制移植瘤的生長，并且腫瘤組織中Ki67、SOX2、VEGF蛋白的陽性表達(dá)率均明顯降低，提示在體內(nèi)miR-198同樣能夠發(fā)揮抑制腫瘤生長、侵襲的作用。

綜上所述，miR-198在RB細(xì)胞中同樣作為抑癌基因發(fā)揮作用，在RB細(xì)胞系Y79細(xì)胞中過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力及侵襲能力均明顯降低，可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期、降低干細(xì)胞特性、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的，同時移植瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其抑制腫瘤的潛在價值。本研究初步探索了miR-198對RB細(xì)胞的作用機(jī)制，為RB細(xì)胞的基因治療提供了新的治療靶標(biāo)。