基于網絡藥理學和文獻探討異喹啉類生物堿抗肝癌研究進展

孫杏倩，蔡俊飛，高家菊，普 娟，馬云淑，2?

（1. 云南中醫(yī)藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；2. 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術研究重點實驗室，云南 昆明 650500）

原發(fā)性肝癌是一種惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展是一個復雜而繁瑣的過程，與多種因素密切相關[1]。研究表明，肝癌不能完全治愈且無有效預防，當前治療肝癌的方法有原位肝移植、肝切除、消融技術、介入療法、放射療法、生物療法、分子靶向療法和中藥治療等[2-3]。但由于局部浸潤和肝內轉移，肝癌術后復發(fā)已成為棘手的問題，患者的預后很差。當前治療方法的局限性主要是對導致疾病異質性的復雜分子信號傳導過程的不完全了解，在治療肝癌的各種方法中，天然藥物治療因其高效、易取、多靶點和副作用少等優(yōu)點引起了國內外研究者的關注。

網絡藥理學已成為一種藥物靶標分析的系統(tǒng)方法，抗癌藥物需要開展大量的基礎研究和應用研究[4-5]，從系統(tǒng)角度和分子水平上發(fā)現中藥，將研究方式從當前的“一種靶標，一種藥物”模式變?yōu)樾碌摹熬W絡靶標，多組分”模式，建立了一種新穎的中藥網絡藥理方法[6]。Guo等[7]基于網絡藥理學預測小檗堿在多種癌癥的預防和治療中的多種藥理作用。

異喹啉生物堿是以異喹啉或四氫異喹啉為母體的最大生物堿類，多種藥理活性，如抗腫瘤、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗炎等[8-10]。該生物堿已顯示出通過多種機制發(fā)揮顯著的抗肝癌作用，包括抑制增殖，誘導細胞凋亡和自噬，轉移和血管生成，調節(jié)各種與癌癥相關的基因及途徑等[11-12]。除了單獨使用之外，發(fā)現與其他化療藥物合用能夠產生協(xié)同作用。通過網絡藥理學，對五種藥物治療肝癌進行篩選，并展示其潛在機制?？傮w來說，基于現有文獻總結和網絡藥理學，可以解釋多種藥物治療肝癌的機制，可能為進一步治療肝癌等疾病提供啟示。本文主要闡述異喹啉類生物堿在肝癌治療方面的作用及其潛在作用機制，為肝癌的相關研究提供參考與借鑒。

1 異喹啉類生物堿基本概況

生物堿（過去稱為嘌呤）是自然界中普遍存在的一類含氮堿性有機化合物，具有類堿性質，且大多具有復雜的環(huán)狀結構，環(huán)中含有氮，具有顯著的生物活性。異喹啉生物堿是生物堿中最重要的類型之一，迄今為止，已從小檗科、防己科、豆科、毛茛科等10種植物中檢測到4 000多種異喹啉生物堿[13]。本文根據文獻報道的頻率在不同類別中著重介紹以下五類生物堿：小檗堿（Berberine，BER）又稱黃連素，為季銨原小檗堿類異喹啉生物堿、漢防己甲素（Tetrandrine，TET）又稱粉防己堿，為雙芐基異喹啉類生物堿、血根堿（Sanguinarine，SAN）為α-萘菲啶類生物堿、青藤堿（Sinomenine，SIN）為嗎啡烷類生物堿，石蒜堿（Lycorine，LYC）為吡咯菲里啶類生物堿[14]。生物堿具有廣泛的藥理活性，且結構多樣，越來越多的學者把目光投向了生物堿。其中以小檗堿研究肝癌的文獻居多，圖1為近幾年五種異喹啉類生物堿研究肝癌的文獻數量情況。

圖1 2012—2019年五種異喹啉類生物堿研究肝癌的文獻數量Fig.1 Literature number of five isoquinoline alkaloids in liver cancer studies from 2012 to 2019

2 基于網絡藥理學數據庫分析

2.1 異喹啉類生物堿抗癌的潛在作用靶點預測

利用 Genecard數據庫平臺，檢索“l(fā)iver cancer”并篩選相關評分≥5的基因，其中得到肝癌疾病的潛在靶點分別為2 816個，利用R預言繪制維恩圖（見圖2），其中與肝癌相關的關鍵靶點基因共有33個。

圖2 肝癌靶點基因與異喹啉生物堿靶點基因的匹配圖Fig.2 Matching of liver cancer target genes with isoquinoline alkaloid target genes

2.2 藥物-活性成分-關鍵作用靶點網絡構建分析

對上述異喹啉類生物堿 5個主要成分進一步通過 TCMSP數據庫搜索潛在靶點 68個，采用Cystoscope軟件構建異喹啉生物堿-活性成分-功能-靶點網絡圖（見圖3），包含58個節(jié)點（1個為異喹啉，5個活性組分與52個靶點），組成73條邊異喹啉類的活性成分與記憶靶點之間相互關系。靶點最多的成分是粉防己堿、節(jié)點最多的靶點的靶點是腎上腺素能受體（Recombinant Adrenergic Receptor Beta 2，ADRB2）、類視黃醇 X 受體（A Retinoid X Receptor，Alpha，RXRA）、煙堿型乙酰膽堿受體（A7 Nicotinic Acetylcholine Receptor，ACHA7）等，提示六種活性成分通過多成分、多靶點作用來預防肝癌的發(fā)生和發(fā)展，通過參與調控肝癌細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等過程。

圖3 異喹啉生物堿5種主要成分與相關靶點的網絡圖Fig.3 Network diagram of 5 main components of isoquinoline alkaloids and related targets

2.3 關鍵靶點基因蛋白質相互作用網絡分析

將異喹啉類五種生物堿抗肝癌治療的 52個潛在靶點基因導入STRING數據庫平臺，選擇物種為人，獲取蛋白質相互作用關系（見圖4），排除三個游離的（無相互作用的蛋白），該網絡圖共包括 28個節(jié)點，91個邊。其中綜合數值評分＞0.999的相互作用蛋白有11個，其中前五個蛋白分別為抑癌基因 p53基因（Tumor Suppressor gene，p53）、核受體共激活劑 2） （Nuclear Receptor Coactivator 2，NCOA2、白介素2（Interleukin-2，IL-2）、細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A（Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A，CDKN1A）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（Cyclin Dependent Kinase 4，CDK4）。文獻查閱發(fā)現，p53是肝癌細胞增殖和凋亡等生物學過程中的重要靶標[15]；小檗堿和血根堿均可提高p53的水平，從而抑制腫瘤細胞生長，血根堿可通過p53介導的細胞增殖、凋亡等，還可參與細胞周期蛋白酶，來治療肝癌[16-17]。

圖4 異喹啉類抗肝癌相關基因的蛋白質相互作用網絡Fig.4 Protein interaction network of isoquinoline anti-hepatocellular carcinoma genes

2.4 生物信息學分析

圖5 相關蛋白質靶點的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of related protein targets

利用WebGestalt分析軟件對相關靶點蛋白進行功能注釋分析（見圖5），包含生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF），這些蛋白在生物過程方面主要參與生物調節(jié)、刺激反應等過程；在細胞方面主要參與構成細胞膜、細胞核和腔上包膜等過程；在分子功能方面與蛋白結合，生長因子受體結合，大分子復合物結合以及蛋白結合等功能，結論五種化合物抑制肝癌生長可能與以上功能過程相關。

2.5 KEGG 通路分析

利用WebGestalt分析軟件對相關靶點蛋白進行KEGG通路富集分析發(fā)現（見圖6）異喹啉類生物堿對治療肝癌的靶標主要與炎癥性腸病、胰腺癌、慢性粒細胞白血病、Th17細胞分化、對小細胞肺癌和非小細胞肺癌、鈣離子信號通路和PI3K/Akt信號通路、松弛信號通路、雌激素信號通路傳導途徑等通路。與基礎研究相互吻合，提示以上結果表明五種生物堿類可通過各通路協(xié)同發(fā)揮作用。

圖6 相關靶點KEGG通路富集分析的前30條通路Fig.6 The first 30 pathways in enrichment analysis of KEGG pathways of related targets

3 基于文獻分析異喹啉類生物堿抗肝癌的作用機制

3.1 誘導腫瘤細胞周期阻滯

細胞周期是包括G0/G1，S和G /M期等的生理過程，細胞增殖受細胞周期調控，細胞周期受一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其關鍵抑制劑的調控[18]。研究表明小檗堿可以對多種肝癌細胞有抑制作用，用小檗堿處理 Huh-7和HepG2細胞后觀察到在細胞周期G0/G1期停滯[19]。FoxO3a（叉形頭轉錄因子的O亞型，在癌癥中表達常下調）和Skp2（p45蛋白，在許多人類癌癥中表達上調）均可參與細胞增殖，促進細胞周期停滯，小檗堿可以通過Huh-7和HepG2肝癌細胞中的 Akt/FoxO3a/Skp2軸誘導生長抑制和細胞周期停滯。張志敏等[20]發(fā)現小檗堿可抑制肝癌HepG2細胞的增殖，通過上調抗增殖基因（BTG2）和下調細胞周期蛋白（CyclinD1）。Tan等[21]研究發(fā)現不同劑量的小檗堿對人肝癌細胞株HepG2有抑制作用，采用流式細胞術發(fā)現高劑量組觀察到亞G0期和G0/G1的增加，且證明蛋白質組分析獲得的數據與我們通過流式細胞術進行細胞周期分析所獲得的數據一致。血根堿能誘導 HepG2和SMMC-7721細胞的S細胞周期停滯[22]。

3.2 誘導細胞凋亡

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，能有序而有效地移除受損的細胞，細胞凋亡的基本調控因子包括激活抗凋亡因子 B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）等或失活促凋亡因子（即p53途徑）[23]。研究發(fā)現抑制p53表達可能會阻止小檗堿誘導的miR-23a的上調，當 miR-23a被抑制時，小檗堿對肝癌細胞 G2/M 細胞周期阻滯、細胞凋亡作用減弱和體內腫瘤生長抑制作用也將減弱[24]。在體內外，小檗堿均可通過抑制C-myc基因（C-myc）抑制谷氨酰胺轉運體（SLC1A5）表達、干擾谷氨酰胺代謝，從而抑制肝癌細胞的增殖[25]。wan等[26]發(fā)現血根堿及其衍生物能夠誘導腫瘤細胞凋亡，其可能是下調Bcl-2和上調Bax（凋亡基因），抑制DNA拓撲異構酶I/II的活性，從而導致細胞凋亡。ROCK1（蛋白激酶 1）的激活在蛋氨酸誘導的線粒體凋亡中起關鍵作用，石蒜堿在體內能抑制HepG2異種移植的腫瘤生長，并通過線粒體依賴性途徑誘導 HepG2細胞凋亡[27]。研究顯示[28]石蒜堿可促進人肝癌HepG2細胞凋亡，機制可能與半胱氨酸蛋白酶（Caspase） Caspase-9、-3、Cyt-C（細胞色素 C）表達水平的升高、Bcl-2蛋白表達的降低有關。粉防己堿使 HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5肝細胞瘤細胞出核碎裂和細胞凋亡等特征[29]。血根堿通過誘導活性氧（ROS）相關的凋亡，以p53依賴性方式顯著抑制HCC細胞增殖。血根堿誘導HepG2和SMMC-7721細胞的早期凋亡，在體內發(fā)現血根堿（10 mg/kg）同樣可以對肝癌生長起抑制作用，且能明顯減少HepG2裸鼠移植瘤模型的瘤體重量，其機制與增加了miR-16-2啟動子上p53的占有率、降低了miR-16靶基因的表達有關[30]。血根堿也可通過誘導ROS發(fā)揮抗增殖作用，并通過線粒體和caspase依賴性途徑引起細胞凋亡。

3.3 誘導細胞自噬

自噬是一個由細胞質中的細胞成分介導的動態(tài)過程，是細胞存活和細胞死亡（自噬細胞死亡）之間的平衡機制，靶向自噬的治療藥物可能對癌細胞有抑制作用[31]。葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）是自噬誘導劑，在自噬調節(jié)中起主導作用。研究表明，小檗堿可以通過激活化轉錄因子6（ATF6）裂解，抑制泛素化和蛋白酶體降解來誘導GRP78表達，從而進一步導致自噬和細胞死亡[32]。小檗堿也可通過細胞中的AMPK（AMP依賴的蛋白激酶）激活和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的失活來誘導HepG2的凋亡和自噬[33]。粉防己堿是一種廣譜有效的自噬激動劑，在HCC細胞中，低劑量的粉防己堿（5μM）誘導（自噬體）膜型LC3-II的表達，導致酸性自噬酶體液泡（AVOs）的形成，可以有效誘導多種細胞系自噬[34]。另外，ROS的產生在促進粉防己堿誘導的自噬中起重要作用，能誘導的肝癌細胞凋亡以Caspase依賴性方式發(fā)生。

3.4 抑制腫瘤細胞侵襲轉移

上皮間充質轉化（EMT）被認為是最初可逆的生物學過程，癌細胞中的部分EMT被認為可以增強其侵襲性，產生循環(huán)的腫瘤細胞和癌細胞干細胞，并增強對抗癌藥物的抗性，在腫瘤中影響顯著[35]。小檗堿可能通過調控轉化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路，干預HepG2細胞的EMT進程，抑制HepG2細胞的遷移和侵襲能力[36]。KLF6（轉染抑癌基因）在肝癌中通過丟失或突變來失控，并且其失活可能誘發(fā)腫瘤，小檗堿能通過抑制野生型 KLF6的過表達，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移[37]。小檗堿通過誘導肝癌細胞中的纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）表達并抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）來抑制 uPA受體，結果表明PAI-1的上調和uPA受體的下調與小檗堿抑制HCC細胞的侵襲和運動有關[38]。Id-1（分化抑制因子）的表達與HCC的增殖、轉移和血管生成有關。小檗堿的治療可以有效抑制Id-1表達并抑制肝細胞癌轉移[39]。轉移性腫瘤抗原1（MTA1）與腫瘤的侵襲和遷移有關，通常在癌癥（例如肝癌）中高表達。在肝癌的體內外實驗中發(fā)現漢防己甲素能夠通過自噬依賴抑制 Wnt /β-鏈接素（β-catenin）信號通路和降低 MTA1表達來抑制轉移[40]。粉防己堿治療明顯降低了MTA1的表達，這表明粉防己堿可以通過MTA1抑制HCC遷移。卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK1）是一種多功能蛋白，可調節(jié)各種細胞功能，石蒜堿可激活ROCK1，從而影響肌動蛋白的細胞骨架動力學，達到抗肝細胞生長和遷移的作用[41]。

3.5 抗腫瘤血管生成

血管生成是新血管從現有血管中生長的過程，血管生成可以通過腫瘤細胞分泌的生長因子來啟動，從而為腫瘤提供更多的氧氣和營養(yǎng)。越來越多的臨床前研究和臨床試驗表明，可通過抑制血管生成來抑制腫瘤生長[42]。血管生成靶標包括血管內皮生長因子及其受體（VEGF/VEGFRs），整聯(lián)蛋白（Avb3）和基質金屬蛋白酶（MMP）。小檗堿是一種有效的抗血管生成劑，其作用主要是通過抑制多種血管生成因子如血小板內皮細胞黏附分子（CD31）和VEGF，同時小檗堿可通過抑制炎癥和血管新生，預防非酒精性脂肪性肝炎衍生的肝細胞癌[43]。

3.6 抑制環(huán)氧合酶2（COX-2）

環(huán)氧合酶2（COX-2）是脂肪酸代謝中的關鍵酶，在炎癥部位由促炎細胞因子誘導的COX-2和增強的COX-2誘導的前列腺素合成，可刺激癌細胞增殖，促進血管生成，抑制凋亡并增加轉移潛力[44]?；ㄉ南┧幔ˋA）的代謝途徑已經與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關。研究發(fā)現，用小檗堿處理 HCC細胞后，胞漿型磷脂酶 A2（cPLA2）和COX-2的蛋白表達水平受到劑量依賴性的顯著抑制，而凋亡誘導因子（AIF）和AA與PGE2的含量比顯著增加。小檗堿可通過抑制HCC中的AA代謝途徑來誘導細胞凋亡[45]。袁婉雯等[46]發(fā)現青藤堿可以誘導肝癌細胞 HepG2阻滯在G1期，其機制可能是抑制COX-2的表達、降低腫瘤細胞中Bcl-2蛋白的含量，或通過抑制PI3K/AKT信號通路，均可誘導HepG2細胞的凋亡。

3.7 抑制NF - kB的活性

核因子κB（NF-κB）蛋白家族成員的二聚體結合形成的誘導型轉錄因子集合的總稱。該家族五個成員為（RelA，RelB，c-Rel，p50和p52）。在所有惡性腫瘤中，NF-κB以細胞類型特異性的方式起作用，激活癌細胞內的生存基因和腫瘤微環(huán)境成分中的促炎癥基因，NF-κB的組成性激活并伴有（IκB蛋白）IκBα失調在肝癌發(fā)生中起到重要作用[47]。實時熒光定量PCR和免疫熒光染色均顯示小檗堿可降低 HepG2細胞中的 NF-κBp65水平，p65的過量表達抑制了小檗堿誘導的細胞增殖，并阻止了HepG2細胞凋亡[48]。

3.8 逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性

在化療藥中多藥耐藥性（MDR）仍然是治療癌癥的主要挑戰(zhàn)，MDR其特征是 ATP依賴性藥物外排轉運蛋白的過度表達[49]。尋找抗 MDR活性的新化合物是解決該癌癥耐藥性問題的一種有效的方法。索拉非尼耐藥是影響肝細胞癌患者預后的主要因素之一，索拉非尼和小檗堿組合對SMMC-7721和HepG2細胞的增殖有協(xié)同抑制作用，呈劑量依賴和時間依賴[50]。Ki67（繁殖基因）是一種增殖細胞相關的基因，化合物 HMQ1611（BCH）和小檗堿合用對HCC增殖和集落形成具有良好的抑制作用，BCH通過抑制細胞周期素（Cyclin）CyclinD1、CyclinE和蛋白激酶（Cdc2）的表達。同時，BCH通過下調Ki67和β-catenin以及上調軸蛋白（Axin）和p-β-catenin來顯著抑制SMMC-7721異種移植腫瘤的生長。提示BCH和小檗堿協(xié)同用藥后在體外和體內均表現出對人肝癌的潛在抗腫瘤活性，而這些活性的潛在機制取決于對 Wnt /β-catenin信號通路的影響[51]。劉城等[52]研究發(fā)現青藤堿與 5-FU聯(lián)合用藥能抑制肝癌細胞系SMMC7721的增殖，且兩藥聯(lián)合應用時，凋亡及壞死細胞比例顯著高于兩藥單用時，提示兩藥合用在抗肝癌作用中可能存在協(xié)同作用。王云等[53]發(fā)現青藤堿與二甲雙胍的協(xié)同用藥對肝癌移植瘤有抑制作用，其機制可能與TGF-β/P38信號通路的激活有關。

3.9 增強輻射敏感性

化療和放射療法的同時治療有可能為患者改善疾病有諸多益處。在藥理和臨床研究中，抗腫瘤劑不僅可以與其他化學治療劑結合使用，還可以與放射線結合使用，以使細胞對放射線敏感，從而增強癌癥的治療功效。小檗堿抑制 Huh7和HepG2細胞中 Nrf2（NF-E2-relatedfactor2）信號相關蛋白的表達，表明小檗堿可通過抑制HCC細胞中的Nrf2信號傳導途徑來增強放射敏感性[54]。將人肝癌 HepG2細胞用黃連素聯(lián)合照射進行處理，小檗堿可顯著增強γ射線的抗腫瘤作用，其機制通過p38 MAPK途徑和ROS的產生增強了抗癌作用[55]。蛋白酶體激活因子（PA28γ）上調在包括肝癌在內的許多惡性腫瘤的癌變過程中起著至關重要的作用。粉防己堿可增強HepG2和LM3細胞的放射敏感性且隨著粉防己堿劑量的增加，放射敏感性增強[56]。

4 討論

肝癌是世界上死亡率較高的最常見的浸潤性腫瘤，尋找有效的藥物來治療惡性腫瘤是一個急需解決的難題。生物堿具有來源豐富、結構多變、效果顯著及毒副作用小等優(yōu)勢，隨著研究日益深入和廣泛應用，異喹啉類生物堿大部分都具有抗腫瘤活性，抗腫瘤靶點和通路比較復雜多樣，不同實驗研究中選擇的腫瘤細胞和模型區(qū)別較大，對大量基礎研究數據進行階段性回顧分析也具有一定的意義。

通過網絡藥理學和文獻總結，構建“異喹啉類生物堿-靶點-基因-肝癌”體系，找出共同的靶點基因，建立了蛋白互作網絡，進行GO富集和KEGG富集，發(fā)現異喹啉類生物堿主要是通過鈣離子和 PI3K-Akt等信號通路與體內生物過程的方式治療肝癌的，驗證基于網絡藥理學的方法對發(fā)現生物活性化合物以及闡明作用機理的有效性，并試圖在兩者之間建立聯(lián)系，擴展異喹啉類生物堿-肝炎體系的多分子，多靶點，多通路的作用機制，為異喹啉類生物堿治療肝癌的具體機制克服了理論基礎，為異喹啉類生物堿的進一步研究提供新的研究策略。