小桐子毛油酶法脫膠工藝研究及機理分析

趙光輝，孫淑坤，曾群英，楊春基，馬克存

（中國石油天然氣股份有限公司 石油化工研究院，黑龍江 大慶 163714）

我國有上千種油料植物，其中以小桐子為代表的木本油料具有含油量高、適應(yīng)范圍廣、耐干旱貧瘠等特點，廣泛栽培或野生于我國的云南、四川、貴州、海南和廣東等非農(nóng)田用地，這不僅符合我國生物質(zhì)能源“不與人爭糧，不與糧爭地”的發(fā)展原則，而且對改善生態(tài)環(huán)境、調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、促進農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、增加農(nóng)民收入等都具有十分重要的意義。小桐子種籽的含油率在28%～40%之間，脫皮后種仁的含油率最高可達(dá)60%，是木本油料中含油量最高的一種植物[1]。其種籽經(jīng)萃取或壓榨出的毛油主要成分是甘油三酯和游離脂肪酸，同時含佛波醇酯和毒蛋白，有毒，不可食用，但卻是制備生物液體燃料（航空生物燃料和生物柴油）和其它化工品的理想原料[2-4]。

由于小桐子毛油中存在一定量的膠溶性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)通常條件下與蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)及鈣、鎂、鐵、鉀等金屬結(jié)合成配位化合物，形成1～100 nm的膠溶態(tài)微粒分散于毛油中[5-7]。將會對后續(xù)的脫色處理、貯存穩(wěn)定性及下游用戶造成極大影響，因此高效的脫膠技術(shù)已成為小桐子油應(yīng)用的關(guān)鍵。目前國內(nèi)外油脂加工廠普遍采用水化脫膠、酸法脫膠或堿煉等傳統(tǒng)工藝脫除膠質(zhì)，具有工藝簡單易行、操作性強等優(yōu)勢，但也存在甘油三酯損失大、輔料消耗多及三廢排放等問題[8-9]。而酶法脫膠具有反應(yīng)過程溫和、工藝簡便、出油率高、節(jié)約能源及環(huán)境友好等優(yōu)勢，受到了學(xué)者和企業(yè)的廣泛關(guān)注。本文通過對酶法脫膠工藝研究及機理分析，以期為小桐子油的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

小桐子毛油：磷含量221.8 μg/g，游離脂肪酸3.92%，自制；復(fù)合磷脂酶（磷脂酶B和磷脂酶C復(fù)配）：夏盛實業(yè)集團有限公司。

檸檬酸、硝酸、鹽酸、過氧化氫：阿拉丁控股集團；硫酸鈉、氧化鉀：天津渤化化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙醇、石油醚、異辛烷：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

Optima 5300DV型等離子發(fā)射光譜儀：美國PerkinElmer公司；ANTEK9000型總氮分析儀：美國ANTEK公司；Multi EA5000型總硫分析儀：德國耶拿公司；ECS3000型總氯分析儀：賽默飛世爾公司；Agilent7890氣相色譜：安捷倫科技公司；ZK072型干燥箱：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；BT323S型電子天平：賽多利斯電子有限公司；TDL-5A型離心機：凱特實驗儀器有限公司。

1.2 毛油酶法脫膠方法

準(zhǔn)確稱取300 g小桐子毛油于500 mL的三口燒瓶中，水浴加熱到 75 ℃后加入 50%檸檬酸0.42 g，高剪切攪拌條件下反應(yīng)30 min。然后冷卻至55 ℃以下，加入適量5%的NaOH溶液混合均勻，將反應(yīng)體系調(diào)整到試驗需要的 pH范圍。再加入一定量的水稀釋酶液，在預(yù)設(shè)溫度和轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后進行離心分離，除去膠質(zhì)，取定量樣品進行分析。

1.3 分析方法

磷和金屬含量：參照GB/T17476—1998；氮含量：參照ASTM D5762—2012；硫含量：參照ASTM D5453—2008；氯含量：參照 ASTM D5808—2009a；不皂化物含量：參照GB/T5535.1—2008；游離脂肪酸含量：參照GB/T5530—2005。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法脫膠單因素試驗

2.1.1 反應(yīng)體系pH對脫膠效果影響

在酶加量40 μg/g、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間2.5 h、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min的條件下，通過控制NaOH溶液的加量，考察了反應(yīng)體系pH對脫膠效果影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)體系pH對脫膠效果影響Fig.1 The pH of the reaction solution to degumming effect

由圖1可見，隨著反應(yīng)體系 pH升高，脫膠油中的磷含量明顯降低；當(dāng)pH超過5.0以后，脫膠油中磷含量反而升高，這主要是隨著堿量增加，導(dǎo)致磷脂酶活性降低所致，因此選擇反應(yīng)體系pH5.0時較適宜。

2.1.2 磷脂酶加量對脫膠效果影響

在反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間2.5 h、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min、pH5.0的條件下，考察了磷脂酶加量對脫膠效果影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶加量對脫膠效果影響Fig.2 Enzyme dosage to degumming effect

由圖2可見，脫膠油中的磷含量隨著酶加量的增加而降低，當(dāng)酶加量超過40 μg/g以后，脫膠油中的磷含量降低趨勢變緩。由此可見，磷脂酶加量在一定范圍內(nèi)決定著脫膠效果，再提高磷脂酶加量對脫膠效果的影響并不明顯，但會增加脫膠成本。從經(jīng)濟性方面考慮，確定酶加量40 μg/g較適宜。

2.1.3 反應(yīng)溫度對脫膠效果影響

在反應(yīng)時間2.5 h、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min、pH5.0、酶加量40 μg/g的條件下，考察了反應(yīng)溫度對脫膠效果影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對脫膠效果影響Fig.3 Reaction temperature to degumming effect

由圖3可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，脫膠油的磷含量呈先降低后上升的趨勢，當(dāng)溫度為55 ℃時，此時脫膠油含磷量降至14.36 μg/g，說明酶促進脫膠反應(yīng)達(dá)到最大水平。由于溫度過低或過高都會影響酶的活性，因此確定脫膠反應(yīng)的最適溫度為55 ℃。

2.1.4 反應(yīng)時間對脫膠效果影響

在攪拌轉(zhuǎn)速 300 r/min、pH5.0、酶加量 40 μg/g、反應(yīng)溫度 55 ℃的條件下，考察了反應(yīng)時間對脫膠效果影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時間對脫膠效果影響Fig.4 Reaction time to degumming effect

由圖4可見，隨著反應(yīng)時間的增加，脫膠油含磷量呈現(xiàn)遞減趨勢。當(dāng)反應(yīng)時間超過3.0 h后，磷含量基本不再發(fā)生變化，因此較優(yōu)的酶反應(yīng)時間確定為3.0 h。

2.1.5 攪拌轉(zhuǎn)速對脫膠效果影響

在pH5.0、酶加量40 μg/g、反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時間3.0 h的條件下，考察了攪拌轉(zhuǎn)速對脫膠效果影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，攪拌轉(zhuǎn)速在250～350 r/min范圍內(nèi)時，增加轉(zhuǎn)速能夠使磷脂酶和水在油相中分散均勻，反應(yīng)界面越大，脫膠油中的磷含量越低。但隨著攪拌繼續(xù)增加，可能是由于攪拌形成的剪切力影響了酶的活性或反應(yīng)體系乳化造成磷脂的殘留，從而造成脫膠效果，因此確定脫膠反應(yīng)轉(zhuǎn)速為350 r/min。

2.2 酶法脫膠正交試驗

根據(jù)單因素酶法脫膠試驗結(jié)果，選取pH、酶加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和攪拌轉(zhuǎn)速等五個因素作為變量，每個因素選取4個水平，以脫膠油中的磷含量作為考察指標(biāo)，根據(jù)因素數(shù)和水平數(shù)選擇L16(45)正交表開展脫膠試驗，結(jié)果見表1。

由極差分析結(jié)果可知，表1中正交試驗各因素的影響順序依次是酶加量＞pH＞反應(yīng)溫度＞攪拌轉(zhuǎn)速＞反應(yīng)時間，由正交試驗結(jié)果可以看出優(yōu)化后的組合為A3B4C3D2E1，即在酶加量 50 μg/g、pH5.5、反應(yīng)溫度50 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、反應(yīng)時間2 h的條件下，酶法脫膠試驗效果最好。

2.3 酶法脫膠驗證試驗及微量組分分析

以小桐子毛油為原料，在酶加量 50 μg/g、pH5.5、反應(yīng)溫度50 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、反應(yīng)時間2 h的條件下，開展了酶法脫膠工藝驗證試驗，并對脫膠油中的微量組分進行了分析，試驗數(shù)據(jù)見表2。

表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Orthogonal test design and results

表2 酶法脫膠驗證試驗及脫膠油微量組分分析Table 2 Enzymatic degumming verifying test and analysis of trace components in degumming oil

從表2可以看出，在該條件下進行驗證試驗，脫膠油中的磷含量最低為9.93 μg/g。脫膠油中的磷、金屬及氮的含量大幅度降低，這主要是由于毛油磷脂中含有金屬離子和氨基，在脫膠過程中酶可將非水化磷脂中的?；袛噢D(zhuǎn)化為溶血性磷脂或磷脂?；?，與水化磷脂遇水時形成液態(tài)水合結(jié)晶[10-11]，再同硫化物、氯化物、不皂化物等同時被沉淀分離出來，使脫膠油中的雜質(zhì)得到不同程度的降低，這對于油品儲存及下游用戶的應(yīng)用是非常有利的。由于毛油脫膠反應(yīng)體系中存在堿液和水，在一定條件下會造成甘油三酯水解，生成游離脂肪酸，導(dǎo)致脫膠油酸度有所升高。

2.4 酶法脫膠反應(yīng)機理分析

毛油中的膠質(zhì)主要是磷脂，所以說“脫膠”也稱“脫磷”。根據(jù)磷脂酸羥基相連的官能團不同，磷脂通常分為水化磷脂和非水化磷脂。酶法脫膠就是利用磷脂酶與油中的非水化磷脂發(fā)生特異性反應(yīng)，切除非水化磷脂中的一個或兩個脂肪酸，生成水化磷脂[12-13]。然后再利用水化磷脂具有很強親水性的特點，通過沉淀或離心分離從油中除去。此法減少了精煉過程中酸堿用量和廢水排放量，提高了生產(chǎn)效率，降低了經(jīng)濟成本，顯示出明顯優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖6 不同磷脂酶的作用位點Fig.6 The site of different phospholipase Hydrolysis phosholipids

由圖6可見，試驗采用磷脂酶B和磷脂酶C的復(fù)合酶，直接作用于磷脂的1號和2號位以及甘油與磷酸鹽之間的P-O鍵上進行特異性反應(yīng)。其中磷脂酶B能特異性水解磷脂1號和2號位上的脂肪酸，生成游離脂肪酸和溶血磷脂[14-16]。由于溶血磷脂具有較強的親水性，可以通過水化作用去除。磷脂酶 C作用于甘油與磷酸鹽之間的P-O鍵，使磷脂分解為親水性組分和溶于油脂的甘油二酯，從而減少油腳產(chǎn)出及其夾帶損失，增加了中性油的產(chǎn)出，具有良好的應(yīng)用前景。磷脂酶C在生物細(xì)胞較為常見，目前己有企業(yè)通過發(fā)酵培養(yǎng)無毒、無致病性的轉(zhuǎn)基因畢赤酵母，提取磷脂酶C，用于油脂的脫膠[17-18]。

3 結(jié)論

利用正交試驗對酶法小桐子毛油脫膠工藝進行了優(yōu)化，確定最佳工藝條件為A3B4C3D2E1，即在酶加量50 μg/g、pH5.5、反應(yīng)溫度50 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、反應(yīng)時間2 h的條件下，脫膠油的磷含量可降9.93 μg/g，其它雜質(zhì)也有不同程度的降低，說明開發(fā)出的酶法脫膠工藝除雜效果明顯。

由于小桐子毛油中的磷、金屬、氮等雜質(zhì)受產(chǎn)地、品種、儲藏時間及壓榨工藝等多因素的影響，其含量變化大、性質(zhì)均不相同，因此油脂加工企業(yè)應(yīng)根據(jù)毛油的性質(zhì)及產(chǎn)品要求，選擇適當(dāng)?shù)牧字负兔撃z工藝條件，以期達(dá)到最佳效果。