克氏原螯蝦PcCyc基因克隆及其對(duì)光周期的表達(dá)響應(yīng)

謝 偉，蔣琦辰，孫 賓，楊 穎，李 鵬，嚴(yán) 潔，周開(kāi)亞

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017 )

周期循環(huán)蛋白基因(Cyc基因)是生物鐘基因的核心基因之一。生物鐘是機(jī)體內(nèi)部周期性接近24 h自我維持的時(shí)鐘。這個(gè)時(shí)鐘由分子振蕩器組成，分子振蕩器由轉(zhuǎn)錄激活因子和時(shí)鐘本身及其他基因的抑制劑組成，分別形成正負(fù)循環(huán)[1]。時(shí)鐘控制的生理和行為過(guò)程中受環(huán)境影響(如光照周期或食物攝入)[2]。Cyc基因是生物鐘環(huán)路中的一個(gè)重要成員，通常其產(chǎn)物蛋白BMAL1蛋白與CLOCK蛋白形成異源二聚體，結(jié)合到period(Per)基因的 E-box盒上激活Per基因轉(zhuǎn)錄，在時(shí)鐘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到正調(diào)節(jié)的作用[3-5]。Cyc基因在脊椎動(dòng)物中的同源基因被稱為Bmal1基因，Bmal1基因于1997年被克隆獲得，是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律鐘的核心轉(zhuǎn)錄因子之一。PAS(PER-ARNT-SIM)結(jié)構(gòu)域存在于多種蛋白質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)在發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境中起作用[6]。PAS結(jié)構(gòu)域也常見(jiàn)于具有堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，并且它們成對(duì)地充當(dāng)異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。Cyc基因包含bHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子[7-8]。bHLH/PAS作為轉(zhuǎn)錄因子，在中央神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用[9-10]。Cyc基因作為重要的生物鐘轉(zhuǎn)錄基因，有許多重要的生理功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠完全喪失晝夜節(jié)律，并完全破壞體內(nèi)葡萄糖和甘油三酯水平的周期節(jié)律。另外特異性敲除小鼠肝胰腺Bmal1基因，會(huì)導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá)喪失晝夜節(jié)律性[11]，并且小鼠在禁食期間存在低血糖風(fēng)險(xiǎn)[12]。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、軟甲亞綱、十足目、爬行亞目、螯蝦科、原螯蝦屬，俗稱小龍蝦，在歐美部分地區(qū)也被稱為紅沼澤螯蝦。近些年在中國(guó)隨著克氏原螯蝦需求量的增加，克氏原螯蝦的人工繁殖培育不斷發(fā)展，養(yǎng)殖面積逐年擴(kuò)大，克氏原螯蝦已成為中國(guó)水產(chǎn)品市場(chǎng)重要的淡水經(jīng)濟(jì)物種[13]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，時(shí)鐘基因的研究已證實(shí)，生物體內(nèi)相關(guān)節(jié)律鐘基因的紊亂可能導(dǎo)致代謝疾病、癌癥、甚至死亡[14-16]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)生物的生理行為、新陳代謝、營(yíng)養(yǎng)獲取等都存在著明顯的節(jié)律。認(rèn)清節(jié)律，遵循節(jié)律的生活方式可以減少患病的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。在養(yǎng)殖過(guò)程中，明確經(jīng)濟(jì)物種的行為、生理、攝食和繁殖等的規(guī)律及其分子調(diào)控機(jī)理可以為健康養(yǎng)殖模式探索提供理論依據(jù)。雖然時(shí)鐘基因在模式動(dòng)物中的研究較多，但在水生甲殼動(dòng)物中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，自甲殼動(dòng)物發(fā)現(xiàn)時(shí)鐘基因以來(lái)，對(duì)其研究多集中于如何保持節(jié)律振蕩及對(duì)生命活動(dòng)節(jié)律的影響方面[19-21]。筆者克隆克氏原螯蝦Cyc基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究不同光照模式下其mRNA組織差異表達(dá)情況，探究Cyc基因的節(jié)律振蕩表達(dá)模式，以期了解克氏原螯蝦生物鐘基因?qū)ζ渖L(zhǎng)發(fā)育及代謝的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)用克氏原螯蝦樣品于徐州(云龍區(qū)周邊水域)野外捕捉采集，為除去性別的干擾，在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)全部選取體長(zhǎng)9～11 cm的雄性個(gè)體?；铙w樣本采集完畢后，需要進(jìn)行光照馴化。在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水箱中飼養(yǎng)15 d，溫度恒定25 ℃，24 h充氧，箱底鋪滿沙石，并放置尼龍管和石塊，模擬克氏原螯蝦自然生境躲避模式。用全光譜日光燈模擬室外光照，光暗比12L∶12D(12LD)。馴化15 d之后將樣品分成3組：第1組是馴化15 d之后的樣品直接用于試驗(yàn)；第2組從中選取健康的雄性個(gè)體54只轉(zhuǎn)入24 h持續(xù)黑暗中0L∶24D(24DD)；第3組選取健康的雄性個(gè)體54尾轉(zhuǎn)入72 h的持續(xù)黑暗中0L∶72D(72DD)。不同光照條件下的克氏原螯蝦均在同一水箱中培養(yǎng)。在不同的光照模式下分別培養(yǎng)結(jié)束后，于時(shí)間點(diǎn)7:00、11:00、15:00、19:00、23:00、翌日03:00、7:00進(jìn)行取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取2尾，共取3個(gè)平行對(duì)照組。使用的試驗(yàn)操作程序經(jīng)南京師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)[SOXR(江蘇)2015-028]批準(zhǔn)。

試驗(yàn)所用引物名稱及序列見(jiàn)表1，引物合成及測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及 cDNA的合成

將克氏原螯蝦的肝胰腺、腦、眼柄組織按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用Thermo NanoDrop 2000/2000C(Thermo Fisher Scientific，USA)分光光度計(jì)和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連)對(duì)克氏原螯蝦的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈。

表1 試驗(yàn)所用的引物序列

1.2.2 PcCyc基因表達(dá)序列標(biāo)簽序列的克隆和測(cè)序

根據(jù)從克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組中(Accession code: SRP044128)[22]獲得的PcCyc基因部分序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物見(jiàn)表1。將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋10倍作為模板擴(kuò)增EST序列。反應(yīng)體系包括：Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，Cycle-ESF 1 μL，Cycle-ESR 1 μL，cDNA 1 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共29個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后與pMD20-T Vector載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆菌落，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后于生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上采用Blast工具進(jìn)行比對(duì)、驗(yàn)證。

1.2.3 PcCyc基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

選取已驗(yàn)證的EST序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE的特異性引物和巢式PCR反應(yīng)的特異性引物。先對(duì)5′RACE PCR進(jìn)行前處理再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對(duì)提取的總RNA進(jìn)行CIAP、TAP處理，與5′RACE Adaptor連接后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。同樣對(duì)3′RACE PCR進(jìn)行前處理，合成cDNA時(shí)要設(shè)立M-MLV(-)對(duì)照。反應(yīng)體系：Total RNA(1 μg/μL) 1 μL，3′RACE Adaptor(5 μmol/L) 1 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each) 1 μL，RNase Free deionized H2O 4.5 μL。反應(yīng)條件：70 ℃，10 min。上述反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰上2 min，然后加入下列組分。反應(yīng)體系：5×M-MLV Buffer 2 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL，Reverse Transcriptase M-MLV (200 U/μL) 0.25 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。之后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。將3′RACE和5′RACE的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化并且連接到PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 RACE PCR序列驗(yàn)證

為驗(yàn)證RACE PCR擴(kuò)增的序列是否正確，以EST序列驗(yàn)證時(shí)的cDNA為模板，使用高保真酶，Cycle-QCF/Cycle-QCR 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系及條件同 EST 序列驗(yàn)證。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定使用 PCR 產(chǎn)物直接純化還是凝膠回收[使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa，大連)切膠回收 PCR 產(chǎn)物]，用 Cycle-QCF/Cycle-QCR 對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Blast驗(yàn)證PcCyc基因的cDNA全長(zhǎng)。用ORF Finder查找PcCyc基因的開(kāi)放閱讀框。在線服務(wù)器ExPASy的ProtParam工具分析PcCYC蛋白相關(guān)的理化性質(zhì)。在線軟件Motif Scan可以用來(lái)搜索PcCYC蛋白的motif。分別用在線服務(wù)器ExPASy的ProtScale工具和在線軟件SignalP分析PcCYC蛋白的疏水性和預(yù)測(cè)分析信號(hào)肽。TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)分析PcCYC蛋白跨膜區(qū)。在線軟件PSORT Ⅱ Prediction預(yù)測(cè)分析PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)域。PcCYC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用PSIPRED。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析使用在線服務(wù)器Zhang Lab。

1.2.6 不同晝夜節(jié)律表達(dá)模式分析

克氏原螯蝦不同光照的樣本用Trizol法進(jìn)行總RNA提?。徊⒏魅?00 ng用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。同時(shí)選定克氏原螯蝦β-actin作為內(nèi)參基因檢測(cè)cDNA模板并設(shè)計(jì)熒光引物，所有的引物見(jiàn)表1。用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)試劑在熒光定量?jī)xABI StepOnePlusTM(Applied Biosystems)上對(duì)不同時(shí)期的各個(gè)組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系：20 μL，包括10 μL 的SYBR?Premix Ex-TaqTMⅡ、0.8 μL 的正反向引物、6.4 μL的PCR反應(yīng)水、2 μL的cDNA模板和0.4 μL ROX。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后分析相關(guān)數(shù)據(jù)，采用比較Ct值的方法(基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct)來(lái)分析PcCyc基因的相對(duì)表達(dá)水平。PcCyc基因表達(dá)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用STATISTIC 10.0進(jìn)行單因子方差分析和Duncan′s多重比較分析，顯著性水平以α=0.05表示。

2 結(jié) 果

2.1 cDNA序列及生物信息學(xué)分析

5′RACE PCR和3′RACE PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分別得到312 bp的5′端序列，1185 bp和1129 bp的3′端序列。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明獲得的RACE PCR產(chǎn)物序列是根據(jù)已知EST序列擴(kuò)增所得(圖1)。PcCyc基因開(kāi)放閱讀框序列擴(kuò)增驗(yàn)證見(jiàn)圖2。

圖1 PcCyc基因RACE PCR序列驗(yàn)證Fig.1 RACE PCR sequence verification of the PcCyc gene M.DL5000 DNA marker; 1、2.PcCyc 基因. M.DL5000 DNA marker; 1,2.cDNA full-length amplified PCR products.

PcCyc基因的cDNA部分序列分析結(jié)果顯示，它具有一個(gè)143 bp的5′端非翻譯區(qū)(UTR)，本試驗(yàn)中并未獲得3′端非翻譯區(qū)，其開(kāi)放閱讀框包含2010個(gè)堿基(GenBank登錄號(hào)MN908586)，編碼669個(gè)氨基酸。PcCyc基因的開(kāi)放閱讀框中還包含一個(gè)典型的bHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)。翻譯過(guò)程中起始密碼子為ATG(位于144～146位)，終止密碼子為T(mén)GA，在本試驗(yàn)中獲得的序列A+T含量為56.5%，G+C含量為43.5%。

圖2 克氏原螯蝦PcCyc基因cDNA序列及氨基酸序列分析Fig.2 cDNA sequence and amino acid sequence analysis of PcCyc gene in red swamp crayfish P. clarkii N表示糖基化位點(diǎn)； *表示終止密碼子； □表示 CK2； ﹏表示 PKC； 藍(lán)色標(biāo)注表示擴(kuò)增過(guò)程中所用到的引物序列. N denotes Glycosylation site; * denotes termination codon; □ denotes CK2; ﹏ denotes PKC and the primer sequence used in the amplification process is shown in blue.

自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心下載Cyc基因產(chǎn)物蛋白的同源序列，使用在線軟件Portal CIPES基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，發(fā)現(xiàn)PcCyc基因與甲殼類的Cyc基因聚為一支，且與十足目通訊螯蝦(Pacifastacusleniusculus)的Cyc基因極為相似，氨基酸相似度為93%(圖3)，表明本試驗(yàn)中擴(kuò)增獲得的PcCyc序列屬于Cyc基因家族。

2.2 PcCYC蛋白性質(zhì)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化特性

PcCYC蛋白的理化性質(zhì)分析使用在線ProtParam工具進(jìn)行，對(duì)克氏原螯蝦PcCYC蛋白質(zhì)的理化參數(shù)分析顯示，PcCYC蛋白的分子量約為73.963 ku，理論等電點(diǎn)為6.56，原子總數(shù)為10 222個(gè)，化學(xué)分子式為C3192H5035N929O1036S30；在組成PcCYC蛋白的20多種氨基酸中，絲氨酸所占的比例最高，達(dá)到13.5%，色氨酸所占的比例最低，為1.2%；脂肪指數(shù)為69.07；不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)到50.54。

2.2.2 PcCYC蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析與Motif搜索

PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析采用SMART在線軟件進(jìn)行，分別給出了PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)功能域及其相關(guān)信息(圖4)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PcCYC蛋白含有BHLH/PAS結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)HLH結(jié)構(gòu)域和2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域可以相互作用形成異二聚體，并結(jié)合下游基因的E-Box區(qū)域，行使其生物學(xué)功能。PcCYC蛋白的Motif搜索利用在線軟件Myhits Motif Scan進(jìn)行。結(jié)果顯示，PcCYC蛋白可能包含19個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)，14個(gè)蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)，12個(gè)豆蔻酸化位點(diǎn)等(圖2)。

圖4 PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析預(yù)測(cè)Fig.4 Analysis and prediction of structure and functional domain of PcCYC protein

2.2.3 PcCYC信號(hào)肽預(yù)測(cè)

SignalP 4.1 Server工具分析PcCYC蛋白并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，因此該蛋白為非分泌蛋白，會(huì)直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，易于富集，在細(xì)胞核中將與PcCLK蛋白形成異二聚體行使其生物學(xué)功能。

2.2.4 PcCYC蛋白亞細(xì)胞定位分析

采用PSORT Ⅱ Prediction在線服務(wù)器對(duì)PcCYC蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，PcCYC蛋白位于細(xì)胞核的可能性為95.7%，定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為4.3%，因此PcCYC蛋白為核蛋白，主要存在細(xì)胞核中。

2.2.5 PcCYC蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用PSIPRED在線服務(wù)器預(yù)測(cè)PcCYC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PcCYC蛋白含有11個(gè)α-螺旋、12個(gè)β-折疊、24個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲。采用在線服務(wù)器Zhang Lab對(duì)PcCYC蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖5中黃色代表β-折疊，藍(lán)色代表α-螺旋，紅色代表無(wú)規(guī)則卷曲；同時(shí)PcCYC蛋白含有2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)BHLH結(jié)構(gòu)域被分別標(biāo)出，它們是PcCYC蛋白與其他蛋白互作行使功能的結(jié)構(gòu)域。

圖5 PcCYC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 The predicted tertiary structure of PcCYC protein

2.2.6 蛋白質(zhì)疏水性

采用在線服務(wù)器ExPASy的ProtScale工具對(duì)PcCYC蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，PcCYC蛋白的最高峰值為2.554，最低峰值為-3.578，表明PcCYC蛋白為疏水性蛋白。

2.3 不同光照下PcCyc基因在不同組織中mRNA的表達(dá)分析

以β-actin基因作為內(nèi)參，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測(cè)了不同光照條件下PcCyc基因在腦、肝胰腺和眼眪3種組織中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，3種光照條件下，PcCyc基因在眼柄和肝胰腺中都基本遵循著24 h的節(jié)律振蕩，而在大腦中的節(jié)律振蕩隨光照周期改變被打破(圖6)。12LD的光照條件下，大腦與眼柄中PcCyc基因基本上有相似的表達(dá)規(guī)律，但在24DD的光照條件下，相似的規(guī)律被打亂了。在24DD光照條件下克氏原螯蝦眼柄中PcCyc基因表達(dá)高峰比12LD條件下的提前了4 h，在72DD條件下，節(jié)律振蕩恢復(fù)，但是與12LD的節(jié)律規(guī)律略有區(qū)別。

3 討 論

生物鐘一直是科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，它是生命對(duì)地球光照以及溫度等環(huán)境因子周期變化長(zhǎng)期適應(yīng)而演化的內(nèi)在自主計(jì)時(shí)機(jī)制[23]。本試驗(yàn)主要采用RACE PCR技術(shù)首次獲得了克氏原螯蝦生物鐘核心基因PcCyc的部分cDNA序列，包括完整的開(kāi)放閱讀框，共2010個(gè)堿基，可編碼669個(gè)氨基酸(即PcCYC蛋白)。截至目前，甲殼類Cyc基因，僅有斑點(diǎn)海虱、通訊螯蝦、沙灘跳鉤蝦(Talitrussaltator)和南極磷蝦(Euphausiasuperba)4個(gè)物種被報(bào)道[8,24-25]。

3.1 克氏原螯蝦PcCyc基因的生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)中使用PcCyc基因翻譯的氨基酸序列對(duì)PcCYC蛋白進(jìn)行相關(guān)的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域分析。其中功能結(jié)構(gòu)域分析PcCYC蛋白含有典型的bHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，在CYC蛋白中該結(jié)構(gòu)域的主要功能是與CLK蛋白結(jié)合成異二聚體在時(shí)鐘調(diào)控網(wǎng)中行使功能[26-27]。對(duì)斑點(diǎn)海虱Cyc基因的研究也顯示，其產(chǎn)物蛋白同樣包含BHLH/PAS結(jié)構(gòu)域[8]。這個(gè)結(jié)構(gòu)域在果蠅、小鼠、人類等的CYC蛋白中普遍存在[26-28]，是CYC蛋白公認(rèn)的結(jié)構(gòu)域之一，也是CYC蛋白的主要功能結(jié)構(gòu)域。表明了CYC蛋白結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中的保守性，也預(yù)示了其功能的保守性。已有研究顯示，甲殼動(dòng)物bHLH-PAS家族的成員通過(guò)幼年激素信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控生長(zhǎng)和繁殖[29]，通過(guò)晝夜節(jié)律計(jì)時(shí)和對(duì)氧張力變化的響應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)[30]。這對(duì)于養(yǎng)蝦業(yè)來(lái)說(shuō)非常重要，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)常面臨可能會(huì)影響?zhàn)B殖產(chǎn)量的環(huán)境條件波動(dòng)的壓力。

圖6 克氏原螯蝦PcCyc基因mRNA表達(dá)水平分析Fig.6 Analysis of mRNA expression levels of PcCyc gene in red swamp crayfish P. clarkii

3.2 克氏原螯蝦PcCyc基因在不同光周期下的組織表達(dá)模式分析

Escamilla-Chimal等[31]利用抗體檢測(cè)了克氏原螯蝦CLK蛋白在不同光照下不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，CLK 蛋白在12LD 的光照條件下，眼柄組織中于12:00出現(xiàn)蛋白表達(dá)高峰，在24DD的光照條件下，腦組織中于16:00出現(xiàn)蛋白表達(dá)高峰，在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中 CYC 蛋白與CLK 蛋白形成異二聚體共同行使功能，因此推測(cè)這兩種蛋白基因可能具有相似的mRNA表達(dá)水平。在時(shí)鐘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，時(shí)鐘基因蛋白的積累會(huì)比mRNA的生成延遲6～8 h[32-34]。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PcCyc基因在不同光照下(12LD、24DD和72DD)克氏原螯蝦不同組織(腦、眼柄和肝胰腺)中的mRNA表達(dá)水平(圖6)。結(jié)果顯示，克氏原螯蝦PcCyc基因在眼柄組織中的mRNA表達(dá)水平與之符合，但是腦組織的表達(dá)有4 h的出入，原因有待進(jìn)一步研究。在24DD與72DD條件下，腦組織中該基因的mRNA的表達(dá)與 Escamilla-Chimal等[31]的結(jié)果相比基本上符合蛋白積累延遲8 h的規(guī)律。在克氏原螯蝦肝胰腺中的PcCyc基因，由于肝胰腺屬于外周振蕩器，不同于眼柄中靠近視網(wǎng)膜上的光感受器，肝胰腺中生物鐘基因的節(jié)律振蕩主要調(diào)節(jié)生物的激素水平[35]，參與調(diào)控機(jī)體的生理生化反應(yīng)振蕩。雖然最終要恢復(fù)起初的振蕩水平，但由于生理生化的調(diào)節(jié)很復(fù)雜，可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間去恢復(fù)原有的節(jié)律振蕩，以使生物適應(yīng)外界環(huán)境的改變。結(jié)果分析顯示，在改變光照的條件下，PcCyc基因慢慢地會(huì)趨于遵循24 h的晝夜周期振蕩節(jié)律，并且在腦組織中有較高的起伏變化，以此證明時(shí)鐘基因PcCyc有顯著的內(nèi)源性自由運(yùn)轉(zhuǎn)節(jié)律，并受腦組織支配。在斑點(diǎn)海虱腦組織中Cyc基因的mRNA表達(dá)雖受到潮汐節(jié)律的影響，但還是遵循著近日24 h的節(jié)律振蕩，且節(jié)律振蕩獨(dú)立由腦控制，外部環(huán)境條件只會(huì)影響節(jié)律，而不會(huì)控制節(jié)律[8]。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)中，采用RACE PCR技術(shù)克隆了克氏原螯蝦的核心生物鐘基因PcCyc的部分cDNA序列(2153個(gè)堿基)，包括2010個(gè)堿基的開(kāi)放閱讀框(編碼669個(gè)氨基酸)；同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PcCyc基因在不同光照模式下(12LD、24DD和72DD)克氏原螯蝦不同組織(腦、眼柄、肝胰臟)中的差異表達(dá)。在改變光照的條件下，PcCyc基因慢慢地會(huì)趨于遵循24 h的晝夜周期振蕩節(jié)律，在大腦中的節(jié)律振蕩隨光照周期改變被打破。試驗(yàn)結(jié)果表明，克氏原螯蝦的時(shí)鐘基因PcCyc有顯著的內(nèi)源性自由運(yùn)轉(zhuǎn)節(jié)律，并受腦組織支配。本試驗(yàn)結(jié)果為研究克氏原螯蝦生物鐘基因?qū)耸显r生長(zhǎng)發(fā)育及代謝的調(diào)控作用奠定了一定的基礎(chǔ)。