液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考

◆作者：莊姜云 唐媛媛 吳永盛

◆單位：湛江市海關(guān)技術(shù)中心食品實驗室

關(guān)鍵字：飼料；氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類抗生素，因?qū)Ω锾m氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的活性，而表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力（馮民等，2013）。重的毒副作用，會引起再生障礙性貧血和灰嬰綜合癥等（李俊鎖等，2002；丁全福等，2001；李佩佩等，2013），因此許多國家和地區(qū)禁止此類藥物用于食品和飼料中。氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）屬于酰氨醇類藥物，曾被廣泛地用于動物各種傳染性疾病的預(yù)防和治療（肖國軍等，2018）。多國已禁止氯霉素在動物疾病防治上的使用，尤其是食品動物。2019 年12 月27 日，氯霉素被列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號）。飼料一般是獸藥添加的主要載體，開展飼料中氯霉素類藥物檢測是從源頭進(jìn)行控制的有效方法，因此研究飼料中氯霉素類藥物檢測的方法具有重要意義。

由于飼料樣品成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾物多，液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法在排除干擾、準(zhǔn)確實現(xiàn)定性、定量分析方面更具優(yōu)勢。本研究以羅非魚飼料為樣品，建立了一種快速、簡便、步驟簡單，同時檢測飼料中3 種酰胺醇類抗生素含量的LC-MS/MS 法，以便對食品動物用飼料進(jìn)行有效監(jiān)控，從而進(jìn)一步確保動物源性食品的安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀1290+G6400 系列三重四極桿質(zhì)譜，配ESI 離子源（美國安捷倫公司）；Anke TDL-5-A,Anke LXJ-ⅡB 離心機(jī)（中國培英公司）；氮吹儀（美國Biotage 公司）；渦旋混勻器XH-B（天翎公司）。

甲醇、乙腈均為色譜級（美國fisher 公司），乙酸乙酯、正己烷均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品），氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均購買Dr.Ehrenstorfer 公司,純度99.0%以上，氘代氯霉素（d5- 氯霉素）,100μg/mL,1mL 購買Bepure，實驗用水符合GB/T 6682 規(guī)定的二級用水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備溶液（500mg/kg）分別稱量經(jīng)折算相當(dāng)于12.5 mg（精確到0.1 mg）的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容于25mL 容量瓶中。氯霉素（10mg/kg）、甲砜霉素和氟苯尼考（100mg/kg）第一標(biāo)準(zhǔn)中間液，準(zhǔn)確吸取0.5mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液、5mL 甲砜霉素、5mL 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500mg/kg）于25mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。氯霉素（1.0mg/kg）、甲砜霉素和氟苯尼考（10.0mg/kg）第二標(biāo)準(zhǔn)中間液，準(zhǔn)確吸取1.0mL 第一標(biāo)準(zhǔn)中間液于10mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配成第二標(biāo)準(zhǔn)中間液。

氯霉素(10μg/kg)，甲砜霉素和氟苯尼考（100.0μg/kg）混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取0.25mL第二標(biāo)準(zhǔn)中間液于25mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配成氯霉素0，0.1μg/kg，0.2μg/kg，0.5μg/kg，1.0μg/kg，2.0μg/kg,4.0μg/kg；甲砜霉素和氟苯尼考0，1.0μg/kg，2.0μg/kg，5.0μg/kg，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

氘代氯霉素（d5- 氯霉素）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.0mg/kg），準(zhǔn)確吸取1.0ml 氘代氯霉素（d5- 氯霉素）標(biāo)準(zhǔn)溶液于25ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。氘代氯霉素（d5- 氯霉素）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液（40μg/kg），準(zhǔn) 確 吸 取0.25mL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.2.2 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse XDBC18 柱，4.6 ×150mm， 粒 度5μm；進(jìn) 樣 量5.0μL；柱 溫30℃；流速：600μL/mL；流動相：溶劑A 為純水，溶劑B 為甲醇，主要液相流動梯度洗脫見表1。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI, 負(fù)離子檢測；監(jiān)測方式：MRM；GAS Flow：7L/min；GAS Temp325℃；Nebulize45 L/min；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速10 L/min，定量為內(nèi)標(biāo)法，主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.2.3 樣品前處理

稱取粉碎后的樣品2g（精確至0.01 g）至50mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液100μL，加入5mL 乙酸乙脂，震蕩15min，超聲提取15min，4500r/min 離心1 0min，移取5mL 上清液于玻璃試管中。再加入5mL 乙酸乙脂提取，震蕩15min，超聲提取15min，4500r/min 離心10min，合并上清液于玻璃試管中。在45℃下氮氣吹干，殘渣用2.0mL 甲醇水溶液（3∶7）溶解，震蕩1min，加入4mL 正己烷脫色脫脂，4500r/min 離心5min，移取下清液于1.5mL 塑料離心管中，在10000r/min 下離心5 min，取清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后上機(jī)測定。

表1 液相流動相梯度洗脫

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的線性關(guān)系

拿羅非魚飼料作為基質(zhì)配制系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶度，氯霉素的溶度范圍為0、0.1μg/kg、0.2 μg/kg 、0.5 μg/kg 、1.0 μg/kg 、2.0μg/kg、4.0μg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的溶度范圍為0、1.0μg/kg、2.0 μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0μg/kg、40.0μg/kg，其中CAP-D5 的溶度為4.0mg/kg，以溶度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)＞0.999，結(jié)果見表3。

2.2 方法的回收率和精密度

選擇一份羅非魚飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗，樣品分別添加氯霉素0.1μg/kg、0.2μg/kg和0.5μg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考1.0μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)液各6 份搖勻、靜置20 min 后按1.2.3 方法處理并進(jìn)行分析，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4，可以看出，各個水平的回收率范圍為94.8%～121.2%，RSD 為3.9%～9.4%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足對飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的方法檢測要求。

2.3 前處理的優(yōu)化

現(xiàn)行國標(biāo)方法中要固相萃取凈化、提取凈化步驟多，消耗時間長，所以本方法用乙酸乙酯提取，全轉(zhuǎn)移，正己烷脫色脫脂，目標(biāo)物回收率好，精密度高，步驟簡單，操作方便，節(jié)約成本，適合大批量的飼料檢測。

2.4 流動相的選擇

以0.1%甲酸水- 甲醇，乙腈- 水，0.1%甲酸水- 乙腈，甲醇- 水來做為流動相比較，流動相甲醇- 水的響應(yīng)值比較高，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考分離效果好，靈敏度高。

表3 3 種化合物的線性回歸方程、線性關(guān)系和線性范圍(n=6)

表4 3 種化合物的加標(biāo)回收率和精密度

3 結(jié)論

本文建立飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，該方法優(yōu)化儀器條件和前處理的凈化步驟，該前處理快速、簡便、節(jié)約成本。具有回收率好、精密度和靈敏度高等優(yōu)點，該方法完全適合現(xiàn)行的檢測要求。