蔬菜液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵培養(yǎng)青春雙歧桿菌的研究

張騰霄，王 斌，蔡宏達，馮俊宇，王瑞祥，張世東

綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是革蘭陽性厭氧無芽孢桿菌，是人和動物腸道內最有益的乳酸菌群[1]，在維持人體健康方面起到不可忽視的作用[2-3]。雙歧桿菌在嬰兒腸道菌群中處于優(yōu)勢地位且呈現(xiàn)多種類共存的微生態(tài)特征，特別是母乳喂養(yǎng)的嬰兒，雙歧桿菌占腸道菌群總數(shù)的90%[4]，但人體腸道內雙歧桿菌等益生菌會隨年齡增大而減少[5]，補充雙歧桿菌等益生菌成為一種公認的保健方法。

液體發(fā)酵法是獲取雙歧桿菌活菌最便捷的方法，當前食品和制藥工業(yè)上用液體培養(yǎng)基規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)雙歧桿菌，然后收集活性菌體冷凍干燥制成沖劑、片劑[6]、微膠囊[7-8]等各種活菌制劑產品，深受廣大消費者的青睞。然而，當前用于發(fā)酵培養(yǎng)雙歧桿菌等益生菌的培養(yǎng)基含有較多動物來源的營養(yǎng)成分，例如牛肉膏、蛋白胨、乳酪素、氯化血紅素等[9-10]，同時還含有多種化學成分，例如L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鉀鹽、乙酸鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽等[11-12]，配制培養(yǎng)基的原料價格昂貴且配制方法煩瑣，存在生產成本高、使用不方便的缺陷。尋找探索新的、價格低廉的益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基原料是亟待深入研究的課題。

我國是蔬菜生產大國，某些蔬菜富含豐富營養(yǎng)物質，包括微生物生長所需要的碳源、氮源、無機鹽和生長因子，因此，以蔬菜作為篩選原料，從中提取天然可溶性營養(yǎng)物質制成雙歧桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，具有原料供應充足、價格低廉的巨大優(yōu)勢，開發(fā)應用前景廣闊。

1 材料與方法

1.1 原料及藥品

黃秋葵、紫薯、番茄、馬鈴薯、胡蘿卜購于綏化市北方果蔬綜合超市；蒙牛純牛奶購于綏化市華辰超市；TPY瓊脂培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；PYG液體培養(yǎng)基配制所用的氯化血紅素、L-半胱氨酸鹽酸鹽、維生素K1：上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、乙醇、考馬斯亮藍G250、三氯乙酸、硫酸、蒽酮、磷酸等藥品均為分析純。

1.2 供試菌株

青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)，從雙歧桿菌活菌膠囊制劑(麗珠集團麗珠制藥廠)中分離純化培養(yǎng)獲得。

1.3 實驗儀器

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BS-2E空氣浴振蕩培養(yǎng)箱：金壇市良友儀器有限公司；SW-CJ-ZF雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；KQ5200ES超聲波清洗器；昆山市超聲儀器有限公司；組織搗碎勻漿機：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；全自動菌落分析儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；微量移液器：泰州市大龍醫(yī)療器械有限公司。

1.4 培養(yǎng)基的制備

1.4.1 蔬菜液體培養(yǎng)基的制備

將黃秋葵、紫薯、番茄、馬鈴薯、胡蘿卜5種蔬菜，分別用自來水洗凈外皮灰塵，各自切成小碎塊，按果蔬碎塊(濕質量)與水質量比為1∶2混合，放入組織搗碎勻漿機中以12 000 r/min勻漿處理5 min。將每種蔬菜的勻漿液轉移到1 000 mL的燒杯中，200 W超聲波破壁處理15 min，然后75 ℃水浴加熱浸提30 min。加熱浸提結束后，趁熱抽濾，棄掉濾渣，保留浸提液并稱質量，按照浸提液質量的2%加入蔗糖，然后分別把黃秋葵、紫薯、番茄、馬鈴薯、胡蘿卜5種蔬菜提取液分裝到250 mL的三角瓶(依次編號為A、B、C、D、E)，每瓶培養(yǎng)基的裝量為250 mL，備用。

1.4.2 牛奶液體培養(yǎng)基和PYG液體培養(yǎng)基的制備

選取牛奶液體培養(yǎng)基和PYG液體培養(yǎng)基作為對照和參比。

量取250 mL純牛奶裝于250 mL的錐形瓶中(編號為F)，用間歇滅菌法滅菌2次，即每次100 ℃ 滅菌10 min，滅菌間隔時間為5 h。

根據(jù)GB 4789.34—2016規(guī)定的方法配制PYG液體培養(yǎng)基[13]。制備完畢后，將其分裝到250 mL的錐形瓶中(編號為G)，每瓶培養(yǎng)基的裝量為250 mL，121 ℃滅菌15 min，自然冷卻備用。

1.4.3 TPY瓊脂鑒別培養(yǎng)基的制備

選取TPY瓊脂鑒別培養(yǎng)基用于測定青春雙歧桿菌活菌濃度。稱取TPY瓊脂46.4 g，在1 000 mL蒸餾水里加熱煮沸至完全溶解，然后分裝于500 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min，滅菌后置于50 ℃烘箱中備用(48 h內使用)，防止凝固。

1.5 青春雙歧桿菌種子液的制備

在超凈工作臺內取1粒雙歧桿菌膠囊(活性青春雙歧桿菌標示含量為5×107CFU·mL-1)，將膠囊內活菌藥粉倒入500 mL滅菌生理鹽水中，振蕩搖勻10 min，得青春雙歧桿菌懸液，作為后續(xù)發(fā)酵試驗接種用的種子液。

1.6 接種及發(fā)酵培養(yǎng)

無菌操作下，吸取1.5中制備的青春雙歧桿菌種子液1 mL分別接種于1.4.1中制備的5種蔬菜液體培養(yǎng)基和1.4.2中制備的2種對照培養(yǎng)基。接種后，放入振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，設置溫度為37 ℃，振蕩速度為100 r/min，各個系列試驗平行3次。發(fā)酵培養(yǎng)期間，每隔一定時間分別取樣，考察青春雙歧桿菌在各類培養(yǎng)基中的生長規(guī)律。

1.7 青春雙歧桿菌在各類培養(yǎng)基中的生長規(guī)律測定

分別從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中取樣，以接種時刻為定期取樣起點，在接種培養(yǎng)0、12、24、48、72 h取樣，用梯度稀釋混合平板法測定青春雙歧桿菌生長動態(tài)變化。操作過程：依次取出各組培養(yǎng)瓶，振蕩均勻后立即精確吸取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，用生理鹽水稀釋104～105倍，再精確吸取1 mL稀釋培養(yǎng)液加入無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入約25 mL的TPY鑒別瓊脂培養(yǎng)基，振蕩混勻，凝固30 min，裝入密封袋，袋內放脫氧劑，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，觀察計數(shù)菌落數(shù)。各個樣品平行取樣3次，活菌計數(shù)取平均值。取樣后的發(fā)酵培養(yǎng)瓶再次封口后放入振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用SPSS軟件對結果進行差異顯著性分析，考察上述各組活菌濃度的差異。

1.8 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中可溶性糖、蛋白質含量的監(jiān)測

分別從上述1.6發(fā)酵培養(yǎng)液中取樣，在接種培養(yǎng)0、12、24、48、72 h取發(fā)酵液樣品4 mL，用于測定伴隨青春雙歧桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液中可溶性糖(碳源)、可溶性蛋白質(氮源)含量的變化，考察培養(yǎng)液中碳源、氮源被利用和消耗的情況。將上述發(fā)酵液樣品4 mL裝于離心管中，9 000 r/min高速離心10 min，除去菌體及不溶性雜質，上清液用三氯乙酸法沉淀蛋白質，收集蛋白質沉淀并復溶，采用考馬斯亮藍法測定其蛋白質的含量。取脫除蛋白的上清液測定其可溶性糖的含量，測定方法采用蒽酮-硫酸法。用SPSS軟件對結果進行差異顯著性分析，考察上述各組碳源和氮源營養(yǎng)物質質量濃度的差異。

2 結果與分析

2.1 青春雙歧桿菌在不同液體培養(yǎng)基中的生長情況

針對試驗組的5種蔬菜液體培養(yǎng)基和對照組的2種液體培養(yǎng)基，在0～72 h的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過對青春雙歧桿菌5個發(fā)酵培養(yǎng)時間點的活菌濃度進行動態(tài)跟蹤測定，得到的青春雙歧桿菌活菌濃度變化情況，如表1所示。

表1 青春雙歧桿菌活菌數(shù)量在7種液體培養(yǎng)基中72 h內的動態(tài)變化Table 1 Dynamic change of the amount of viable Bifidobacterium adolescentis in 7 liquid culture media within 72 h

2.2 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中可溶性糖、蛋白質含量的變化

培養(yǎng)基中的碳源和氮源的供給水平及青春雙歧桿菌對其吸收利用水平是影響青春雙歧桿菌繁殖、存活的最主要的影響因素。監(jiān)測試驗組的5種蔬菜液體培養(yǎng)基和對照組的2種液體培養(yǎng)基，在0～72 h的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中可溶性糖、蛋白質含量的變化情況如圖1、圖2所示。

圖1 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中可溶性糖含量的變化Fig.1 Change of soluble sugar content in fermentation broth

圖2 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中可溶性蛋白質含量的變化Fig.2 Change of soluble protein content in fermentation broth

從圖1、圖2可知，各種培養(yǎng)基的初始碳源、氮源營養(yǎng)物質的含量及比例均存在明顯差異(P<0.05)。按培養(yǎng)基中初始可溶性糖(碳源)的質量濃度由大到小的順序排列為D(49.56 mg·mL-1)、E(45.95 mgmL-1)、F(40.91 mg·mL-1)、B(35.85 mg·mL-1)、A(29.37 mg·mL-1)、C(28.71 mg·mL-1)、G(5.08 mg·mL-1)，但培養(yǎng)青春雙歧桿菌的效果并不是初始的可溶性糖的質量濃度越高越好，對比發(fā)酵結束時糖的消耗量(發(fā)酵開始至結束時的質量濃度差)可知，A、E的消耗量較高，分別為21.30 mg·mL-1、21.07 mg·mL-1，F(xiàn)、B和D的消耗量分別為13.80 mg·mL-1、11.02 mg·mL-1、8.93 mg·mL-1，結合表1可知，糖的消耗量越高所獲得的青春雙歧桿菌活菌濃度越高，培養(yǎng)液中可利用糖的供給能力是決定青春雙歧桿菌生長繁殖的關鍵因素。從對糖的利用率角度看，青春雙歧桿菌對G、A和E的利用率較高，分別為100%、72.52%、45.85%，對C、D和B的利用率較低，分別為4.46%、18.02%、30.74%。PYG中碳源為葡萄糖，黃秋葵中碳源為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖6種單糖組成的多糖[14]，而馬鈴薯和紫薯中的碳源為淀粉。因此，青春雙歧桿菌能很好地利用葡萄糖及黃秋葵多糖，而難以利用淀粉。

按培養(yǎng)基中初始可溶性蛋白質(氮源)的質量濃度由大到小的順序排列為G(30.33 mg·mL-1)、F(29.19 mg·mL-1)、A(9.23 mg·mL-1)、D(7.02 mg·mL-1)、B(6.36 mg·mL-1)、E(5.11 mg·mL-1)、C(1.24 mg·mL-1)，結果顯示初始的可溶性蛋白質的質量濃度與培養(yǎng)效果呈非正相關關系，作為對照的G組和F組雖然蛋白質含量最高但并沒有呈現(xiàn)活菌濃度的最大值，而蛋白質含量處于第3位的A組獲得了活菌濃度的最大值，E組蛋白質含量偏低卻獲得較高的活菌濃度。綜合比較，A組和E組的共同特點是蛋白質的利用率均最高，為100%，且糖的利用率也高，分別為72.52%、45.85%。因此，7種培養(yǎng)基中的糖和蛋白質的性質存在差異，被青春雙歧桿菌吸收利用的程度存在差異，只有兩者的利用率均高時才能獲得較高的活菌濃度。

2.3 青春雙歧桿菌在每種液體培養(yǎng)基中不同時間點生長規(guī)律分析

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，從宏觀角度分析，除了C組(番茄)外，青春雙歧桿菌在6種液體培養(yǎng)基中的生長繁殖均呈現(xiàn)大致相同的生長趨勢，即從接種后均經歷了遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的較為典型的分批發(fā)酵生長曲線，各組均在發(fā)酵培養(yǎng)的0～12 h內增殖速度緩慢，均處于遲緩期，各組均在發(fā)酵培養(yǎng)72 h處于衰亡期，這反映了青春雙歧桿菌對營養(yǎng)條件依賴性強且容易衰老死亡，與文獻[15-16] 研究結果一致。但各組的對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期持續(xù)時間不同，各組的活菌濃度峰值大小存在明顯差異。

從接種到發(fā)酵培養(yǎng)72 h的過程中，青春雙歧桿菌在A組(黃秋葵)和B組(紫薯)表現(xiàn)出相似的生長規(guī)律，兩組都是從12～48 h處于對數(shù)期，直至培養(yǎng)48 h左右才達到生長峰值，之后活菌濃度迅速下降，對數(shù)期持續(xù)時間長，但兩者的活菌濃度峰值存在顯著差異(P<0.05)，分別為6.832×107CFU·mL-1、2.671×107CFU·mL-1，A組的活菌濃度峰值是B組的2.56倍，且A組的活菌濃度峰值最大，高于其他6種培養(yǎng)基，培養(yǎng)效果最好。青春雙歧桿菌在D組(馬鈴薯)、E組(胡蘿卜)、F組(牛奶)和G組(PYG)呈現(xiàn)相似的生長規(guī)律，12 h后生長加速，在培養(yǎng)24 h后活菌濃度達到最大，隨后菌體濃度逐漸下降。與A組和B組相比，其特點是對數(shù)期持續(xù)時間短，達到活菌濃度峰值時間短，比A、B組提前了24 h。其中，D組在培養(yǎng)至24 h活菌濃度達峰值后急速下降，衰亡速度非?？?，而其余3組的活菌濃度達峰值后下降得相對平緩。青春雙歧桿菌在C組沒有呈現(xiàn)典型的生長曲線，發(fā)酵12 h活菌濃度低于接種初始濃度，發(fā)酵至24 h時沒有檢測到活菌存在，這說明接種后，在番茄液體培養(yǎng)基內直接進入衰亡期，青春雙歧桿菌不能在此種培養(yǎng)基內增殖。

在分批發(fā)酵模式中，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分比例越協(xié)調、含量越高，菌體繁殖密度越高[17]。當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分(特別是限制性營養(yǎng)成分)被菌體利用完畢時，菌體生長進入衰亡階段[18]。7種培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)青春雙歧桿菌效果好的3種為黃秋葵、胡蘿卜和紫薯，達到活菌濃度峰值的發(fā)酵時間分別為48 h、24 h、48 h，由此可知，黃秋葵、胡蘿卜和紫薯提取液中的維持菌體生長的營養(yǎng)成分種類及濃度較高，再結合圖1和圖2可知，該培養(yǎng)效果的產生與3種培養(yǎng)基中的可溶性糖和蛋白質的利用率高密切相關，特別是黃秋葵(與胡蘿卜、紫薯相比)所含的可溶性糖和蛋白質含量均較高且兩者的比例均衡。

2.4 青春雙歧桿菌在相同時間內不同液體培養(yǎng)基中的生長規(guī)律分析

表1表明：接種初始(即0 h時)，在7種培養(yǎng)基中接入了相同濃度的活菌，且以低濃度的活菌群體接種量作為測試起點。發(fā)酵12 h后，除了番茄培養(yǎng)基活菌濃度下降外，其他6種培養(yǎng)基均有不同程度的增殖，其中，以D組(馬鈴薯)、F組(牛奶)、E組(胡蘿卜)3種培養(yǎng)基中活菌濃度較高，推測其中的某些營養(yǎng)成分能夠刺激青春雙歧桿菌快速增殖，縮短了遲緩期。發(fā)酵24 h后，番茄培養(yǎng)基活菌濃度降低至零，而青春雙歧桿菌在其他6種培養(yǎng)基中均繼續(xù)增殖，且以較高的生長速率增殖，其中的黃秋葵、紫薯、馬鈴薯、牛奶、PYG 5種液體培養(yǎng)基內菌體濃度大致相同，而胡蘿卜液體培養(yǎng)基的活菌濃度最大，高達4.320×107CFU·mL-1，對青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)效果均優(yōu)于對照組F和G。發(fā)酵48 h后，各組的活菌濃度差異最為顯著，各種培養(yǎng)基對青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)效果形成強烈對比，顯然黃秋葵培養(yǎng)基對青春雙歧桿菌的增殖培養(yǎng)效果最好，其次為E組、B組。發(fā)酵72 h后，青春雙歧桿菌在6種液體培養(yǎng)基中的活性均顯著降低，只有E組、F組和G組中還殘存有較多的活菌。

C組對青春雙歧桿菌的培養(yǎng)效果最差，對其原因進行分析：1)番茄液體培養(yǎng)基在高溫滅菌后析出大量不溶性沉淀物，即大量營養(yǎng)物質在高溫滅菌條件下轉變?yōu)椴蝗苡谒某煞郑蚨荒鼙磺啻弘p歧桿菌所利用；2)結合圖1和圖2數(shù)據(jù)分析，發(fā)酵液初始可溶性蛋白質含量太低(0.12 mg/mL)，不能滿足青春雙歧桿菌對氮源的需求量，番茄自身的含糖量也非常低(3.30 mg/mL)，且不容易被青春雙歧桿菌吸收利用，利用率最低；3)對滅菌后的番茄液體培養(yǎng)基總有機酸含量進行測定，測定方法采用標準堿液滴定法[19]，總有機酸的含量為1.06 mg·mL-1，可見培養(yǎng)基初始有機酸含量高，抑制了菌體生長繁殖。

3 結論

對5種蔬菜液體培養(yǎng)基和對照組的2種液體培養(yǎng)基中的初始可溶性糖(碳源)、可溶性蛋白質(氮源)含量進行測定，結果顯示2種營養(yǎng)物質在各種培養(yǎng)基中含量及比例均存在明顯差異。發(fā)酵培養(yǎng)青春雙歧桿菌的結果顯示，初始的可溶性糖和蛋白質的質量濃度與培養(yǎng)青春雙歧桿菌的效果沒有呈現(xiàn)典型的正相關，這與7種培養(yǎng)液中的糖和蛋白質的性質存在差異有關，兩者被青春雙歧桿菌吸收利用的程度存在差異，只有兩者的利用率均高時才能獲得較高的活菌濃度，例如黃秋葵、胡蘿卜制成的液體培養(yǎng)基中所含可溶性糖和蛋白質均不高，但兩者的利用率卻都較高，均獲得了較高的活菌濃度。

在人體胃腸道內雙歧桿菌的活菌濃度必須達到106CFU·mL-1以上才能發(fā)揮明顯的益生作用[20-21]，本研究中選取的黃秋葵、紫薯、馬鈴薯、胡蘿卜4種蔬菜液體培養(yǎng)基在0～72 h的發(fā)酵培養(yǎng)試驗期間，對應的活菌濃度峰值分別為6.832×107、2.671×107、1.600×107、4.320×107CFU·mL-1，均超過了106CFU·mL-1益生作用的濃度底限，其中，黃秋葵液體培養(yǎng)基對青春雙歧桿菌的增殖作用具有絕對優(yōu)勢，不僅活菌濃度峰值高出其他培養(yǎng)基數(shù)倍，而且菌體對數(shù)生長期維持時間較長。

在牛奶和PYG 2種標準對照培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)24 h菌體濃度均達到最大值，分別為1.568×107、1.456×107CFU·mL-1，而黃秋葵、紫薯、馬鈴薯、胡蘿卜4種蔬菜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)青春雙歧桿菌的活菌濃度的峰值超過了PYG、牛奶2種標準對照，這表明以黃秋葵、紫薯、馬鈴薯、胡蘿卜為原料的液體培養(yǎng)基均可替代PYG、牛奶2種液體培養(yǎng)基用于青春雙歧桿菌活性菌體的發(fā)酵生產。