表沒食子兒茶素沒食子酸酯二元醇脂質(zhì)體的制備及體外透皮性質(zhì)研究

宋 娟，呂成志，王 棟，丁 峰，于緒東

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶提取物茶多酚的主要活性成分，約占兒茶素總含量的80%[1]。研究表明，EGCG對(duì)白癜風(fēng)、紫外線輻射、銀屑病、痤瘡、保健美容等多種皮膚科疾病有效[2-5]。然而EGCG結(jié)構(gòu)中B環(huán)上C3'，C4'和C5'上的羥基及C環(huán)上C3位的沒食子酸極易在光照、高溫、堿性等條件下發(fā)生氧化、聚合、縮合等變化，導(dǎo)致其體內(nèi)外分解快速，穩(wěn)定性較差。且EGCG較強(qiáng)的水溶性致使其皮膚滲透性差，進(jìn)一步限制了其在皮膚病治療中的應(yīng)用[6-8]。

二元醇脂質(zhì)體（binary ethosome）是對(duì)乙醇脂質(zhì)體改進(jìn)后得到的一種新型的經(jīng)皮給藥載體，采用二元醇相（包括乙醇和丙二醇）代替單純的乙醇制備的二元醇脂質(zhì)體，具有生物相容性好、制備工藝簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定、皮膚滲透性及滯留性強(qiáng)等特點(diǎn)[9-11]。因此，筆者采用乙醇和丙二醇組成的混合醇代替單純的乙醇首次制備了EGCG二元醇脂質(zhì)體（EGCG-EL），并對(duì)EGCG-EL的體外透皮性質(zhì)進(jìn)行考察。

1 材料

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（1525 Binary泵、2487 UV檢測(cè)器、Breeze 色譜工作站，美國 Waters 公司）；TK-12A 型 Franz 擴(kuò)散池（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JY92-II 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）；LP 220S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Nano ZS90 粒度儀（英國Malvern 公司）；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器（中國金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試劑

EGCG原料（杭州禾田生物科技有限公司，純度95%）；EGCG對(duì)照品（上海友思生物技術(shù)有限公司，純度＞98%）；大豆卵磷脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；丙二醇（湖南爾康高科藥業(yè)有限公司）；乙醇（大連川連酒廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 EGCG-EL的制備

采用乙醇注入法制備EGCG-EL。稱取EGCG、磷脂及膽固醇（磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為10:1）置于密閉容器中，加入適量的乙醇和丙二醇（體積比為2:1）混合溶液溶解，隨后置于磁力攪拌器上。在30℃條件下，用注射器將純化水以緩慢細(xì)流狀注入至上述溶液中，注完后繼續(xù)攪拌適當(dāng)時(shí)間，將得到的水性混懸液超聲后過0.22 μm濾膜，即得EGCG-EL。

2.2 EGCG-EL中EGCG含量測(cè)定

2.2.1 HPLC 色譜條件色譜柱：Elite-ODS柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲 醇:水:乙 酸=23:75:2；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 溶液的配制 空白脂質(zhì)體溶液：精密量取 0.1 ml不含EGCG的空白脂質(zhì)體溶液置10 ml量瓶中，加甲醇 3 ml，超聲 1 min 后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，取上清液過0.45 μm 濾膜即得空白脂質(zhì)體溶液。供試品溶液：精密量取 0.1 ml EGCG-EL 溶液置10 ml量瓶中，加甲醇 3 ml，超聲 1 min 后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，取上清液過0.45 μm 濾膜即得供試品溶液。

2.2.3 專屬性 精密量取EGCG對(duì)照品溶液、空白脂質(zhì)體溶液、供試品溶液各 20 μl，按1.2.2.1方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示溶劑、輔料及雜質(zhì)對(duì)EGCG測(cè)定無干擾，見圖 1。

圖1 HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系 精密稱取EGCG對(duì)照品 10.0 mg，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別吸取 0.5、1、2、4、8 ml 置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以EGCG的峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸。得回歸方程A=24501C-30829，r=1，表明EGCG在5.0～ 80.0 μg/ml濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度精密量取 0.1 ml 空白脂質(zhì)體溶液置10 ml 量瓶中，分別加入 0.1 ml 低、中、高三個(gè)濃度（1.6，2.0，2.4 mg/ml）的 EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋 30 s，加甲醇 3 ml 超聲 1 min 后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，取上清液過 0.45 μm 濾膜。精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算得到低、中、高3個(gè)濃度EGCG 平均回收率分別為101.7%、100.5%、100.3%（n=3），RSD 分別為 0.35%、0.11%、0.35%。

2.2.6 精密度 取“線性關(guān)系”項(xiàng)下20.0 μg/ml溶液，精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.69%。

2.2.7 穩(wěn)定性 取供試品溶液，室溫放置，分別于0和4 h精密量取20 μl，注入色譜儀，記錄色譜峰面積，色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.17%，表明供試品溶液在室溫放置4 h穩(wěn)定。

2.3 EGCG-EL質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 EGCG-EL的外觀 采用目測(cè)法，觀察制備的EGCG-EL外觀，肉眼觀察EGCG-EL為半透明乳狀液，且?guī)黠@的乳光（圖2）。

2.3.2 EGCG-EL的粒徑及Zeta 電位 取EGCGEL適量，以水為稀釋遞質(zhì)，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定EGCG-EL的粒度及其分布和Zeta電位。采用乙醇注入法制備的EGCG-EL粒徑分布均勻（圖3），平均粒徑為（144.5±11.3）nm，PDI為 0.19±0.04。EGCGEL的Zeta 電位為 -34.8 mV，EGCG-EL所帶相同電荷之間的排斥作用能夠有效的阻止脂質(zhì)體的相互聚集，提高EGCG-EL的聚集穩(wěn)定性。

圖2 EGCG-EL的外觀

圖3 EGCG-EL的粒徑分布

2.3.3 pH值 磷脂易氧化水解，其氧化水解速率受環(huán)境pH值的影響較大，只有在一定的pH范圍內(nèi)才比較穩(wěn)定。因此，本文采用pH計(jì)對(duì)EGCG-EL的pH值進(jìn)行測(cè)定。本文測(cè)得EGCG-EL的pH值為6.38±0.10，利于脂質(zhì)體和藥物的穩(wěn)定性。

2.3.4 EGCG-EL的包封率 采用超濾-HPLC法測(cè)定EGCG-EL的包封率。精密量取EGCG-EL 0.2 ml置10 ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，取稀釋后的樣品，置超濾離心管中（超濾膜截留相對(duì)分子量50 000 Da），10 000 r/min離心20 min，測(cè)定游離藥物濃度（C游離），另精密量取EGCG-EL 0.1 ml置10 ml量瓶中，加一定量的甲醇后超聲，采用流動(dòng)相稀釋至刻度，測(cè)定總藥量（C），按包封率（%）=（C-C游離）÷C×100%計(jì)算3批樣品的包封率為（65.91±1.45）%。

2.3.5 EGCG-EL中藥物含量測(cè)定 采用HPLC測(cè)定EGCG-EL中EGCG的含量。精密稱取0.1 ml置10 ml量瓶中，加入3 ml甲醇后超聲，采用流動(dòng)相稀釋至刻度。取上清液過 0.45 μm 濾膜。精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算EGCG的含量。結(jié)果顯示3批樣品的含量為（2.21±0.02）mg/ml。

2.4 大鼠體外經(jīng)皮滲透性及皮膚滯留量考察

2.4.1 離體皮膚的制備 取斷頸處死的雄性SD大鼠，用電動(dòng)剃毛器剔除大鼠腹部鼠毛，剝離腹部皮膚，并除去皮膚上的脂肪及多余組織，生理鹽水漂洗干凈后將其放置-20℃條件保存，并在7 d內(nèi)使用。

2.4.2 體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn) 采用 Franz 擴(kuò)散裝置進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)，將處理好的大鼠皮膚固定于供給池和接受池之間，分別取 2 ml EGCG-EL及EGCG溶液劑（EGCG-S），置于供給池中，并將其頂部密封。接受池中注滿生理鹽水，使得接受液與鼠皮充分接觸，無氣泡。將此裝置置于（32 ± 0.5）℃恒溫水浴中，磁力攪拌，分別于0.5、1、2、4、6、12、24 h取出5 ml接受液，并立即補(bǔ)加同溫同體積新鮮接受液。采用 HPLC法測(cè)定不同時(shí)間接受液中EGCG的濃度，按如下公式計(jì)算單位面積累積透過量（Q）：Q=Cn?！罺/A 。以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)作圖，得到藥物體外經(jīng)皮滲透曲線，見圖4。由圖可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，EGCG-EL的累積透過量要明顯的大于EGCG-S，但二者的藥物累積透過量總體均很小，這會(huì)使血液中的藥量降低，不良反應(yīng)減少，有利于皮膚科疾病的治療。Cn校=Cn測(cè)+Vi÷V×∑Cp，式中Q為t時(shí)間單位面積累積透過量（μg/cm2），Cn校為校正后接受液中藥物的濃度；Cn測(cè)為第n次取樣測(cè)得接受液中藥物的濃度；V和Vi分別為接受池中接受液的總體積和每次取樣體積；∑Cp為該取樣點(diǎn)前各點(diǎn)的測(cè)定濃度之和；A為有效透皮擴(kuò)散面積。

圖4 EGCG兩種制劑單位面積累積透過量

2.4.3 皮膚內(nèi)藥物滯留量試驗(yàn) 待透皮試驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，反復(fù)用蒸餾水洗凈皮膚表面殘存的藥物，濾紙吸干水分后剪去周邊的皮膚，稱重，將皮膚剪碎，置于超聲管中，加入3 ml甲醇，超聲5 min，將上清液移入至5 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液20 μl進(jìn)樣，測(cè)定皮膚中滯留的藥物濃度，計(jì)算單位面積皮膚中EGCG的滯留量，結(jié)果如表1。由表1可知，EGCG-EL的大鼠體外皮膚滯留量為（526.82±6.37）μg/g，要明顯的高于EGCG-S（P＜0.001）。

表1 EGCG兩種制劑單位面積皮內(nèi)滯留量（±s）

表1 EGCG兩種制劑單位面積皮內(nèi)滯留量（±s）

制劑平均滯留量(μg/g)EGCG-S 114.10±8.75 EGCG-EL 526.82±6.37

3 討論

本研究采用乙醇和丙二醇組成的混合醇代替單純的乙醇制備的EGCG-EL，一方面能夠通過增加醇脂質(zhì)體的黏度及負(fù)電荷來提高EGCG-EL的穩(wěn)定性，另一方面降低了乙醇在處方中所占的比例，抑制乙醇揮發(fā)且減弱了其對(duì)皮膚的刺激性。

采用超濾-HPLC法測(cè)定EGCG-EL的包封率發(fā)現(xiàn)該制劑的包封率偏低，這是因?yàn)橛H水性小分子藥物在制備過程中易發(fā)生泄露導(dǎo)致，盡管如此，EGCGEL的透皮性能仍優(yōu)于普通溶液劑。

體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG在二元醇脂質(zhì)體中的累積透過量及皮膚滯留量要顯著大于溶液劑，這是由于乙醇的加入一方面改變了角質(zhì)層脂質(zhì)分子的緊密排列，增加了脂質(zhì)的流動(dòng)相，另一方面乙醇能夠增加二元醇脂質(zhì)體膜的柔韌性及流動(dòng)性，使得在經(jīng)皮給藥的過程二元醇脂質(zhì)體易于變形，透過紊亂的角質(zhì)層，從而增加藥物的皮膚滲透性。同時(shí)在經(jīng)皮滲透的過程中二元醇脂質(zhì)體能夠與角質(zhì)層的脂質(zhì)融合，釋放藥物，這種融合作用會(huì)進(jìn)一步增加EGCG的滲透性。通過對(duì)制劑的皮膚滯留量研究發(fā)現(xiàn)，EGCG-EL與EGCG溶液劑相比能顯著提高EGCG在皮膚中的滯留量。